Un protocollo Infettare

C. elegans è emerso come un nuovo modello genetico per studiare le interazioni ospite-patogeno. Qui si descrive un protocollo per infettare C. elegans con Salmonella typhimurium accoppiato con la tecnica RNAi doppio filamento interferenze per esaminare il ruolo dei geni ospitanti in difesa contro le infezioni da Salmonella.

Nell'ultimo decennio, C. elegans è emerso come un organismo invertebrato per studiare le interazioni tra i padroni di casa e agenti patogeni, tra cui la difesa ospite contro i gram-negativi batterio Salmonella typhimurium. Salmonella stabilisce infezione persistente nell'intestino di C. elegans e si traduce in morte precoce di animali infetti. Un certo numero di meccanismi immunitari sono stati identificati in C. elegans per difendersi contro le infezioni da Salmonella. Autofagia, un evolutivamente conservata degradazione lisosomiale percorso, ha dimostrato di limitare la replica Salmonella in C. elegans e nei mammiferi. Qui, un protocollo è descritto per infettare C. elegans con Salmonella typhimurium, in cui i vermi sono esposti a Salmonella per un tempo limitato, simile alle infezioni da Salmonella nell'uomo. Salmonella infezione riduce notevolmente la durata di C. elegans </ Em>. Utilizzando il gene autofagia essenziale bec-1 come esempio, abbiamo combinato questo metodo infezione da C. elegans RNAi alimentazione approccio e ha mostrato questo protocollo può essere utilizzato per esaminare la funzione di C. geni ospitanti elegans in difesa contro le infezioni da Salmonella. Poiché C. elegans intero genoma librerie RNAi sono disponibili, questo protocollo permette di schermare completamente per la C. elegans geni che proteggono contro la salmonella e altri patogeni intestinali utilizzando le librerie RNAi genome-wide.

Il nematode del suolo a vita libera Caenorhabditis elegans è un semplice e geneticamente trattabili organismo modello utilizzato per studiare molte questioni biologiche. C. elegans esiste prevalentemente come ermafroditi auto-fertilizzazione. I maschi sono spontaneamente generati da non disgiunzione del cromosoma X durante la gametogenesi ^1,2. In presenza di cibo abbondante, C. elegans sviluppare continuamente attraverso quattro stadi larvali all'adulto. La temperatura influisce anche C. sviluppo elegans; sviluppo più rapido si osserva a temperature più elevate. In laboratorio, C. elegans è coltivato ad una temperatura standard di 20 ° C su piastre di agar con seminato batterio Escherichia coli (ceppo OP50) come alimento ^1,2.

Nell'ultimo decennio, C. elegans è emerso come un organismo invertebrato per studiare le interazioni ospite-patogeno ^3-5. In natura, C. elegans mangia i batteri come nutrient ^1,2 fonte. La sua normale cibo laboratorio batterica, OP50, può essere facilmente sostituito con altri patogeni per esaminare le interazioni tra C. elegans e qualsiasi agente patogeno scelta. In queste condizioni, l'intestino è il sito primario dell'infezione. Infatti, una vasta gamma di patogeni batterici ha dimostrato di infettare lethally C. elegans ^3-5.

Il batterio Salmonella gram-negativa è un agente patogeno gastrointestinale che causa malattie di origine alimentare umana in tutto il mondo ^6,7. C. elegans è un buon modello di accoglienza per la Salmonella typhimurium come questo batterio si replica e presenta infezioni intestinali persistenti ^8-10. C. elegans è stato usato per identificare sia nuovo e precedentemente noto virulenza di Salmonella fattori ^11. È interessante notare che il C. sistema immunitario elegans limita con successo la replica Salmonella. E 'stato riportato in precedenza che inibition di geni autofagia rende maggiore la replica di Salmonella in C. elegans, con conseguente morte precoce di vermi infetti ^10. Macroautofagia (di seguito denominato autofagia) è un processo dinamico che coinvolge il riassetto delle membrane subcellulari di sequestrare citoplasma e organelli per la consegna agli lisosomi per la degradazione ^12. Autofagia è stato segnalato per limitare la replica Salmonella in C. elegans e nei mammiferi ^10,13.

La C. elegans genoma è stato il primo genoma degli eucarioti multicellulari sequenziato; è sensibile alle RNAi trattamento ^14-16. Inoltre, RNAi può essere somministrato efficacemente sottoponendo vermi ingerire batteri contenenti l'RNA a doppio filamento del gene bersaglio, noto come RNAi alimentazione ^16,17. Genoma biblioteche alimentazione RNAi interi sono stati generati per il genoma di screening RNAi ^16,18. Qui, una Salmonella infezione proprotocollo è accoppiato con RNAi alimentazione per consentire la sperimentazione C. elegans geni di interesse per la loro capacità di proteggere contro l'infezione da Salmonella.

1. Piastre XLD (xilosio lisina Desoxycholate) Agar

XLD agar è un terreno di coltura selettivo per Salmonella, che appare come colonie nere su piastre di agar XLD. Tuttavia, se non ci sono problemi di contaminazione, un piatto regolare LB può essere sostituito.

1. Pesare 5,5 g di agar XLD e risospendere in 5 ml di acqua deionizzata.
2. Mescolare accuratamente fino a quando tutti agar è bagnato. Aggiungere 95 ml di acqua deionizzata fino a quando tutti i grumi sono andati e il mezzo è completamente risospese.
3. Far bollire il mezzo per sciogliere completamente (non autoclave).
4. Raffreddare il terreno a temperatura ambiente a 50 ° C.
5. Versare 25 ml di agar-agar in ciascuno di 95 x 15 mm (diametro x altezza) targa (targhe sigillati con parafilm possono essere conservati a 4 ° C per un massimo di 1 mese).

2. Nematode Growth Medium (NGM) RNAi alimentazione Piatti

Preparazione di C. piastre NGM elegans è stato descritto in precedenza ¹9. Qui una procedura viene brevemente descritta aggiungere ampicillina e l'RNAi induttore chimico isopropil β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) in media NGM per rendere le piastre di alimentazione RNAi.

1. Sciogliere 3 g di NaCl e 2,5 g Bacto peptone in 1 L di acqua deionizzata.
2. Aggiungere 17 g di agar Bacto nei media.
3. Autoclavare media per 45 minuti e raffreddare il supporto a 50 ° C in un bagno d'acqua.
4. Aggiungere le seguenti soluzioni: 1 ml di colesterolo (5 mg / ml in 95% etanolo), 1 ml di 1 M CaCl _2, 1 ml di 1 M _MgSO4, e 25 ml di 1 M tampone fosfato di potassio (pH 6,0). Mescolare bene.
5. Aggiungere 1 ml di 1 M IPTG e 500 microlitri ampicillina (100 mg / ml in acqua sterile).
6. Mescolare bene la soluzione e versare in 60 x 15 mm (diametro x altezza) piastre di Petri con un apparecchio Pipettare e 25 ml pipetta sierologica seguenti procedure sterili. Riempire ogni piatto con 12 ml di agar. Le piastre possono essere conservati a 4 ° C per un massimo di 1 mese.

3. Preparare RNAi-animali trattati per l'infezione

Il gene essenziale autofagia bec-1 viene utilizzato come esempio per esaminare la funzione di un gene ospitante in difesa contro l'infezione da Salmonella. Le procedure sperimentali sono illustrati nella figura 1 e nella tabella 1. Il protocollo per la preparazione RNAi animali trattati per l'infezione segue, con il giorno di ogni fase sperimentale dato tra parentesi.

1. Seminare bec-1 alimentazione RNAi e controllare vettore vuoto L4440 RNAi alimentazione batteri mettendo un fiocco di -80 ° C i batteri congelati in 2 ml di terreno LB integrato con 100 mg / ml ampicillina (1 ° giorno). Ripetere questa operazione una volta alla settimana durante l'intero esperimento di avere batteri RNAi freschi. Conservare la cultura nel 4 ° C frigorifero quando non è utilizzato.
2. Seed 100 ml di coltura batterica durante la notte RNAi su lastre di RNAi. Preparare tre bec-1 RNAi e tre di controllo vuota vettore piatti RNAi. Incubare le piastre a 37 ° C per una notte (Day 2).
3. Rimuovere le piastre di RNAi dal 37 ° C incubatore e permettere loro di raffreddare a temperatura sulla panchina stanza. Pick up ben nutriti L4 wild type ermafroditi N2 e trasferire loro di Bec-1 RNAi e controllo vettoriale piatti RNAi vuoti. Inserire tre vermi per piastra, su piastre in triplo. Lo stesso giorno, preparare piatti RNAi come descritto al punto 3.2 (3 ° giorno).
4. Incubare le piastre RNAi con i vermi in incubatore a 20 ° C per 36-40 hr e trasferire i vermi a piatti freschi RNAi corrispondenti preparati nella fase 3.3. Dopo i vermi vengono trasferiti, incubare le piastre nel 20 ° C incubatore per 64 ore (giorno 4).

4. Preparare Salmonella per infezione

1. Streak Salmonella -80 ° C Si congelati su 1 piastra XLD agar ed incubare la piastra a 37 ° C durante la notte (Day 5 ).
2. Scegli una ben isolata Salmonella bianco colonia e inoculare in 2 ml di terreno LB a 37 ° C con agitazione tutta la notte (Giorno 6).
3. Seed 80 ml ​​Salmonella cultura durante la notte il 1 ° C. elegans 60 x 15 mm (diametro x altezza) piastra NGM agar e preparare 6 piatti in totale. Incubare le piastre a temperatura ambiente per 6 ore. La coltura batterica devono asciugare e formare un prato sulla piastra (7 ° giorno).

5. Worms Infect RNAi trattati con Salmonella

1. Trasferimento bec-1 RNAi-trattati e controllo vettoriale RNAi trattati ermafroditi L4 N2 vuoti (progenie di vermi istituito nel passaggio 3) alle piastre Salmonella. Mettere 40 vermi per piastra su 3 piastre per ogni gruppo. Incubare le piastre a vite senza fine a 20 ° C per 48 ore (7 ° giorno).
2. Preparare una serie di lastre di RNAi freschi come descritto nei punti 3.1 e 3.2 (Day 7 e Giorno 8).
3. Dopo 48 ore l'infezione, trasferire i vermi Salmonella-infetti ai corrispondenti piastre RNAi preparati in fase 5.2 e incubare a 20 ° C (9 ° giorno).

6. Sopravvivenza Assay

1. Punteggio la sopravvivenza di vermi quotidiano e trasferire i vermi di corrispondenti lastre di RNAi freschi durante il periodo di deposizione delle uova. Preparare una serie di lastre di RNAi fresco prima di ogni trasferimento verme come descritto nei punti 3.1 e 3.2. Toccare il corpo senza fine (testa, parte centrale e la coda) delicatamente con un filo di platino end-appiattita. Un worm è segnato come morta, se si osserva alcun movimento del corpo worm.
2. Punteggio la sopravvivenza di vermi giorno o ogni altro giorno, e trasferire i vermi alle corrispondenti piastre RNAi freschi due volte a settimana dopo i vermi fermano la deposizione delle uova.
3. Dopo che tutti i vermi muoiono, riunire i dati di sopravvivenza da lastre triplice copia come un set di dati. Inserire i dati di sopravvivenza di ogni gruppo nel caso di software statistico come GraphPad Prism per generare curve di sopravvivenza e di effettuare analisi di sopravvivenza di Kaplan-Meier. L'intero esperimento viene ripetuto almeno una volta a confermare la conclusione.

A 20 ° C, la durata mediana di wild type vermi N2 è 17 giorni (Figura 2a e Tabella 2). Infezione da Salmonella diminuisce significativamente la durata mediana di vermi N2 a 10,5 giorni (p = 0,0002, log-rank test) (Figura 2A ).

Se una C. gene elegans svolge un ruolo importante nella difesa contro le infezioni da Salmonella, si prevede che la sua inibizione impartirà suscettibilità alle infezioni Salmonella. Infatti, rispetto alla Salmonella infettati controllo RNAi trattato N2 animali, la durata mediana di Salmonella infettati bec-1 RNAi trattato N2 worm è diminuito da 10,5 giorni a 9 giorni (p <0,0001, log-rank test) (Figura 2B e Tabella 2). La durata massima è drammaticamente accorciata di 14 giorni (da 24 giorni a 10 giorni Figura 2B e Tabella 2). Inoltre, l'esserec-1 RNAi ha alcun effetto evidente sulla durata della vita di vermi N2 che non siano infettati da Salmonella (p = 0,2593, log-rank test) (Figura 2C e Tabella 2), indica che l'infezione da Salmonella, non bec-1 trattamento RNAi, diminuisce la durata della vita di Salmonella-infettati bec-1 worm RNAi-trattati. Inoltre, bec-1 è un gene essenziale in C. elegans difesa contro le infezioni da Salmonella.

Figura 1. Diagramma di flusso delle procedure sperimentali.

Figura 2. Inibizione di bec-1 gene da RNAi conferisce susceptibility alle infezioni da Salmonella in C. elegans. curve AC) di sopravvivenza degli animali selvatici tipo N2 trattati con il controllo di vettore vuoto RNAi o bec-1 gene RNAi a seguito di una esposizione due giorni di Salmonella typhimurium o Escherichia coli non patogeni a 20 ° C. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Tabella 1. Infezione da Salmonella protocollo lasso di tempo.

Tabella 2. L'analisi statistica deidurata della vita dati della Figura 2.

C. elegans è un organismo semplice modello genetico che mangia i batteri come fonte di nutrienti. Così, è facile da sostituire la alimentare batterica normale con un patogeno intestinale per indagare le interazioni tra C. elegans e l'agente patogeno scelto. Qui un protocollo è descritto combinare Salmonella infezione e C. elegans RNAi alimentazione trattamento per esaminare il ruolo dei geni ospitanti in difesa contro le infezioni da Salmonella. Protocolli di precedente infezione espongono C. elegans vermi ai batteri patogeni tra cui Salmonella durante la loro vita ^20. Nel presente protocollo, Salmonella infetta i vermi in un periodo di due giorni. Dopo di che, i vermi non sono più esposti alle infezioni da Salmonella. Questa infezione Salmonella diminuisce significativamente la durata di C. elegans tipo di animali selvatici. Così, invase Salmonella replicare vermi all'interno e uccidere gli animali ¹⁰ . Questo breve periodo di esposizione alla Salmonella imita infezione da salmonella umana, che dovrebbe aiutare a scoprire informazioni utili per capire malattie di origine alimentare umana causata da infezione da Salmonella. Inoltre, questo protocollo combina il trattamento di alimentazione RNAi con Salmonella infezione, rendendo possibile testare eventuali geni candidati che potrebbero essere coinvolte nella difesa dell'ospite contro l'infezione da Salmonella, specialmente quando i mutanti genetici non sono disponibili. Il gene autofagia bec-1 noti per essere coinvolti nella difesa contro le infezioni Salmonella viene utilizzato come esempio nel presente studio. Mutazioni bec-1 sono letali ^21, che impedisce testando il suo ruolo nella difesa contro le infezioni da Salmonella negli adulti. Utilizzando il protocollo attuale, è stato dimostrato che l'inibizione di bec-1 da RNAi cede suscettibilità alle infezioni da Salmonella in C. elegans. Nel presente studio, N2 tipo worm selvatici fed con i batteri L4440 hanno una durata simile a animali nutriti con OP50. Gli animali cominciano a morire intorno al giorno 6 e la massima durata è di circa quattro settimane. Worm N2 infettati da salmonella vivono pochi giorni più corto. Al contrario, bec-1 worm RNAi trattati con infezione da Salmonella muoiono circa due volte più veloce rispetto agli animali di controllo, anche se la data di inizio per gli animali a morire in entrambi i gruppi è a pochi giorni di distanza (Figura 2). L'intero esperimento dura circa 1 mese.

In questo protocollo, è necessario il coordinamento di RNAi alimentazione e preparazione Salmonella in modo che RNAi trattati ermafroditi stadio L4 sono sottoposti a infezione da Salmonella. Un periodo di tempo tipico del protocollo utilizzato in laboratorio degli autori sono descritte nella Tabella 1. RNAi batteri alimentazione sono preparati settimanale e la coltura batterica è conservato a 4 ° C quando non utilizzato. Di nota, il giorno 7, l'infezione si avvierà 60; ora dopo le culture durante la notte Salmonella sono posti su piastre NGM. Durante questo periodo di 6 ore, RNAi trattati ermafroditi L4 N2 vengono raccolte dai corrispondenti bec-1 e controllo vettoriale piatti RNAi vuoti. I vermi non infetti vengono utilizzati come controlli per accertare se l'infezione da Salmonella accorcia la durata del worm infetti e se bec-1 trattamento RNAi ha alcuna influenza sulla durata della vita senza fine.

Attualmente, la sopravvivenza di C. elegans dopo l'infezione è comunemente usato per misurare l'agente patogeno virulenza ^3-5. Tuttavia, RNAi inibizione di alcuni C. geni elegans risultato in diminuzione durata della vita. Pertanto, si dovrebbe fare attenzione quando si interpretano i dati. Quando si incontra questa situazione, diverse concentrazioni della induttore RNAi, IPTG, possono essere testati per identificare la concentrazione desiderata che influenza solo la risposta dell'ospite alle infezioni patogeni senza impatto sulla vita animale. Come riportato in precedenza ^{10, la concentrazione di 1 nM IPTG è stato usato con successo per esaminare il ruolo dell'autofagia in IGF segnalazione mediata resistenza patogeno in C. elegans.}

Dato che il C. elegans genoma è stato sequenziato e C. biblioteche alimentazione elegans RNAi sono stati generati ^16,18, è possibile rivedere il protocollo descritto per eseguire uno screening RNAi di tutto il genoma per identificare tutti i geni dell'ospite coinvolti nella difesa contro le infezioni da Salmonella. Ad esempio, invece di utilizzare la sopravvivenza mediana per misurare la virulenza di Salmonella, è utilizzato la sopravvivenza massimo. Inoltre, worm infetti possono essere sterilizzati completandola piastre con fluorodeossiuridina, un inibitore della sintesi del DNA. Quindi, il trasferimento di vermi infetti è inutile fintanto che il cibo viene fornito per evitare che i vermi dalla fame. Queste modifiche riducono il carico di lavoro per uno schermo high-throughput tremendamente. Questo tipo di studio su larga scala può sluce hed sulla comprensione della risposta umana alle infezioni da Salmonella altrettanti percorsi biologici in C. elegans sono evolutivamente conservati negli esseri umani.

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.

Ringraziamo il Dott. Diane Baronas-Lowell per la lettura critica del manoscritto. Questo lavoro è stato supportato da un FAU Charles E. Schmidt College of Science Seed Grant e una borsa di studio invecchiamento della Ellison Medical Foundation di KJ