Lievito luminometrici e

Per completare i metodi comunemente usati per studiare TRPV4 di, sono descritti due metodi: la sua mechanosensitivity può essere studiato da Ca ^{2 +} luminometria-aequorina in lievito transgenico upon sfida ipo-osmotico. Può pure esaminato TRPV4-RNA oociti di Xenopus iniettati da cellula intera clamp a due elettrodi tensione o Patch Clamp on-cella o modalità asportato.

TRPV4 (Transient Receptor Potenziali, famiglia vanilloid, tipo 4) è ampiamente espressa nei tessuti vertebrati ed è attivato da diversi stimoli, tra cui da forze meccaniche. Alcune mutazioni TRPV4 causano complesso osso ereditaria o patologie neuronali umano. Wild-type o mutante TRPV4 transgeni sono comunemente espresse in cellule di mammifero in coltura ed esaminati dalla Fura-2 fluorometria e da elettrodi. In termini di meccanismo mechanosensitivity e le basi molecolari delle malattie, la letteratura attuale è confusa e controversa. Per completare metodi esistenti, si descrivono due metodi aggiuntivi per esaminare le proprietà molecolari di TRPV4. (1) Rat TRPV4 e un transgene aequorina si trasformano in lievito in erba. Uno shock ipo-osmtic della popolazione trasformante produce un segnale luminometrici causa della combinazione di equorina con Ca ^{2 +,} rilasciato attraverso il canale TRPV4. Qui TRPV4 è isolato dai suoi abituali partner di proteine ​​di mammiferie rivela la propria mechanosensitivity. (2) cRNA di TRPV4 viene iniettato in oociti di Xenopus. Dopo un adeguato periodo di incubazione, la corrente TRPV4 macroscopico viene esaminato con un morsetto di tensione a due elettrodi. L'attuale aumento dopo la rimozione di osmoticum inerti dal bagno ovocita è indicativo di mechanosensitivity. I microampere (10 ^-6 a 10 ^-4 A) correnti da ovociti sono molto più grandi rispetto alle subnano-to nA (10 ^-10 a 10 ^-9 A) correnti da cellule in coltura, producendo quantificazioni più chiare e valutazioni più sicuri. Correnti microscopiche che riflettono le attività delle proteine ​​dei singoli canali possono anche essere direttamente registrati sotto una patch clamp, in on-cella o in modalità asportato. Lo stesso ovocita fornisce più campioni di patch, consentendo la replica dei dati migliori. Aspirazioni applicate le patch possono attivare TRPV4 per valutare direttamente mechanosensitivity. Tali metodi dovrebbero anche essere utile nello studio di altri tipi di canali TRP.

TRP (potenziali recettori transitori) comprendono sette sottofamiglie di canali di comunicazione che servono funzioni sensoriali ^1,2. Nei mammiferi, TRPV, sottofamiglia vanilloid del TRP, ha sei varietà. TRPV4 (tipo 4) ^3,4 risponde al calore, alcune sostanze chimiche, gonfiore osmotico, o shear stress. Il gene TRPV4 stato ripetutamente isolato mediante candidato-gene e / o espressione clonazione ^5-8. Quest'ultimo metodo seguito la risposta del prodotto genico di ipo-osmolarità. TRPV4 è espresso in quasi tutti gli organi e le funzioni per lo sviluppo, fisiologia, patologia o di molti tipi di cellule disparate ^3,4.

Striking sono le autosomiche dominanti umano mutazioni TRPV4> 50, causando neuropatie periferiche e / o displasie scheletriche (anomalie nello sviluppo scheletrico) ^9-11. La gamma di displasie scheletriche da lievi tipo brachyomia 3 (tipo 3 nanismo), displasia spondilometafisaria tipo Kozlowski, a Severe displasie, alcuni causando la morte neonatale o embrionale. Anche se tutte le maniere di meccanismi sembrano possibili, nessuno spiega la diversità, la complessità, la variabilità e sovrapposizioni occasionali di queste malattie ^4.

Come altri canali TRP ^1, TRPV4 è un tetramero. Nel ratto o TRPV4 umana, ogni subunità è costituita da 871 residui. Il suo elemento centrale è il sei transmembrana una eliche (S1-S6), che sono probabilmente disposti in un modo simile a K ⁺ canali voltaggio-dipendenti. Lì, S1 a S4 formare un dominio periferico e la S5 e S6 formano il dominio permeazione poro. Tra S5 e S6 di TRPV4 è un'elica poro breve seguito dal LDLFKLTIGMGDL sequenza, quattro delle quali presumibilmente convergono per formare il filtro catione. Il 470-residuo N-terminale del segmento citoplasmatico contiene 6 ripetizioni ankyrin, noti per legare le proteine ​​o piccoli ligandi. Il 152-residuo segmento citoplasmatica C-terminale include una sequenza-calmodulina legame tra gli altri possibili siti che legano oti suoi elementi ^3.

TRPV4 è un canale cationico che esclude essenzialmente anioni ^1. Mentre la sua funzione fisiologica è per trasdurre stimoli a Ca ^{2 +} afflusso, è anche permeabile ai cationi attraverso una sequenza permeabilità Eisenman IV, favorendo bivalente a P _Ca: P _Na ~ 7 ^12. Conduttanza monocanale rettifica a ~ 90 pS verso l'esterno e verso l'interno ~ 40 pS ^6,13,14. Eterologamente espressa corrente (in basso) può essere attivato da ipo-osmotico gonfiore, sforzo di taglio, o di calore ^15. Inoltre è stato attivato da acidi grassi polinsaturi ^16,17 e l'estere sintetico phorbal 4αPDD ^18. Allo stato attuale, il più potente agonista è GSK1016790A ¹⁹ e antagonista è GSK2193874, efficace nel 10 ^-9 a 10 ^-8 M ^20, entrambi scoperti da alta velocità, schermo piccolo-molecolare.

Due settori chiave della ricerca TRPV4 rimangono confuse: (1) Anche se TRPV4 è ampiamente studiato per la sua mechanosensitivity, la sua base molecolare è controversa. Un modello descrive ipo-osmolarità qualche modo attiva la fosfolipasi A2 (PLA2) per produrre l'acido grasso polinsaturo (PUFA) acido arachidonico (AA), che viene convertito in acido epoxyeicosatrienoic (TEE) da un epoxygenase, e il legame di EET attiva TRPV4 ^{16, 17.} Eppure, TRPV4 si è dimostrato di rispondere direttamente ai membrana tratto ¹⁴ (sotto), fornendo una spiegazione più semplice. (2) Le patologie mutanti TRPV4 sono sconcertanti. Alla base, si ha la necessità di sapere se le malattie sono dovute alla perdita, la riduzione o l'aumento di attività di canale. Anche qui, la letteratura è tutt'altro che chiara. Mentre alleli multipli scheletrico-displasia sono stati segnalati per avere attività superiori, (guadagno-di-funzione, GOF) ^4,21, vari sono stati segnalati per aver ridotto le attività (perdita-di-funzione, LOF) ^10,22. Uno studio sistematico di 14 alleli li ha trovati pertutte le mutazioni essere GOF (sotto) ^23. L'affermazione che alcuni sono LOF sembra contraddire il fenotipo di TRPV4-/ - topo knockout, che sono vitali o fertili, con solo piccoli difetti, nonostante una perdita completa della funzione TRPV4.

Una parte di queste polemiche ha origine metodologica. I laboratori usano metodi diversi, o varianti di un metodo, e utilizzano diversi standard di giudizio. Più comunemente, TRPV4 viene transitoriamente espresso in cellule di mammifero in coltura (HEK, CHO, HeLa) e l'ascesa di interno [Ca ^{2 +]} sulla agonista o stimolazione ipotonico è registrato con il colorante fluorescente ⁺ sensibile Ca ^2, Fura-2. L'eccessivo affidamento su questo test fluorimetrico è stato criticato ^1. Il livello di espressione in differenti popolazioni, la distribuzione in esso, nonché la concentrazione di colorante efficace, deve essere controllato e documentato. Più attendibile è esami elettrofisiologici diretti. Anche questo, come commonly praticato, inoltre, non è senza problemi. Poiché i livelli di espressione in cellule coltivate individuali sono difficili da controllare, correnti di cellule intere hanno grandi variazioni. Inoltre, perché le correnti sono piccole, statistiche affidabili dovranno fare affidamento su campioni di grandi dimensioni, spesso non è pratico. Raramente sono stati effettuati gli esami di patch-clamp. Alcune di queste registrazioni mostrano gruppi di scoppi di attività che rendono la valutazione statistica impegnativo ^16,17.

Per capire meglio il mechanosensitivity molecolare, abbiamo sviluppato due sistemi aggiuntivi per esaminare TRPV4. (1) Per isolare TRPV4 lontano dai suoi abituali partner di mammiferi, abbiamo espresso ratto TRPV4 in erba lievito ^24. Espressione funzionale di TRPV4 in questo contesto evolutivamente distante ha dimostrato che potrebbe ancora rispondere alla forza osmotica senza i suoi abituali partner. Perché il lievito non rilascia acidi grassi polinsaturi come AA o EET, e il suo genoma non ha PLA2 o epoxygenase geni, questa espresSsion dimostra anche che non sono necessari per TRPV4 di percepire la forza. Avere TRPV4 in eucarioti biologicamente più suscettibili molecolari permette anche manipolazioni efficiente avanti o indietro genetici ^25. (2) Per le analisi biofisiche di TRPV4 in profondità, abbiamo espresso TRPV4 in ovociti di Xenopus. A differenza delle cellule coltivate, che producono sub-nA a nA (10 ^-10 a 10 ^-9 A) correnti, un ovocita esprime correnti μA di (10 ^-6 a 10 ^-4 A). Molto più grande segnale su rumore consente una migliore quantificazione e comparazione più sicuri. TRPV4, così espresso, può anche essere esaminata come singole molecole utilizzando una patch clamp. Un singolo ovocita permette il campionamento di patch ripetuto, ancora una volta rendendo quantificazione più attendibile. Tali studi hanno dimostrato che canale TRPV4 stessa può essere attivata direttamente con la forza membrana tratto ^14. Le analisi hanno inoltre dimostrato che 14 rappresentative alleli scheletrico-displasia sono tutte le mutazioni guadagno-di-funzione. Inoltre, il Degree di questa costitutiva Ca ^{2 +} perdite parallelo alla gravità delle malattie scheletriche ^23.

A causa della loro novità e l'utilità, le modalità dettagliate di questi due metodi sono riuniti qui per consentire repliche in futuro la ricerca sulle TRPV4 o canali simili.

1. Metodi di lievito luminometria

Utilizzare ceppo BYYT di Saccharomyces cerevisiae. Si tratta di un yvc1-tok1-derivato di BY4741 (Mata, ura3D0, his3D1, leu2D0, lys2D0, yvc1 :: HIS3, tok1 :: kanMX4). Trasformare cellule con i-equorina esprimendo pEVP1/Aeq plasmide Leu-selezionabili e ura selezionabili rat--TRPV4 esprimendo plasmide p416GPDV4, come descritto in Batiza et al. ²⁶ e Loukin et al. ^{24 Con} metodi standard di costruzione plasmide e trasformazione ²⁷ . Ceppo di lievito e plasmidi sono disponibili su richiesta.

1. Cultura 2 ml di cellule di lievito durante la notte a fase post-logaritmica in uno shaker 30 ° C in leu-ura-"DCD" dropout medio ²⁸ (una variante solfato-impoverito del mezzo CMD-leu-ura ^29), integrato con 1M sorbitolo . Seminare 200 ml di queste culture in 1,8 ml di mezzo fresco integrato con 2 micron del Luciferin coelenterazina. Crescere al buio a temperatura ambiente per altre 24 ore senza agitare.
2. Misurare la osmolarità della cultura (tipicamente a 1.400 mOsm) e altre soluzioni (sotto) usando un osmometer pressione di vapore.
3. Aliquota 20 ml di coltura fresca in un tubo luminometro 12 mm per un singolo luminometro tubo.
4. Per lo shock ipotonico, aggiungere 200 ml di una soluzione contenente 25 NaEGTA mM (pH 7,2) o nomi (pH 7.2) e 500-100 mM NaCl, (osmolarità totale di 1,200-400 mOsm) a seconda del grado di shock desiderato. Monitorare costantemente la luminescenza prima e almeno 120 secondi dopo la downshock osmotica, interrotta solo dalla breve operazione di diluizione. Registrati uscita luminometer su un computer desktop come unità di luminescenza relativa (RUL).

Anche se non per lo studio di TRPV4 transgenico, abbiamo utilizzato una variante del protocollo di cui sopra in un sistema automatizzato per esaminare le risposte di un gran numero di ceppi di lievito. Studio of risposte alle ^ipo-30 o iperosmotico ³¹ stimoli del deletome lievito (la raccolta di 4.906 lievito deletants un singolo gene) usando un luminometro micropiastre e analizzati con il software corrispondente ha avuto successo.

2. e 3. Ovociti Metodi di Elettrofisiologia

Elettrofisiologia utilizza metodi di base ^32. PCR amplifica la cornice open-lettura della wild-type o TRPV4 mutante con alta fedeltà PfuUtra polimerasi e integrato nel pGH19 ^33. Ciò comporta un inserimento preciso della ORF tra i 5 'e 3' UTR del Xenopus β-globina ed a valle di un promotore T7 RNA polimerasi. Linearizzare il costrutto valle UTR in 3 'e usato come modelli in vitro un T7 RNA polimerasi in reazione. Utilizzare tecniche di biologia molecolare standard di ^34.

Utilizzare fase V-VI ovociti da X. laevis. Zootecnia, ovariecto parzialela mia, la rimozione busta defolliculation, e vitellina seguire procedure standard ^32,33,35. Iniettare 2-40 ng di soluzione di cRNA per ovocita con un microinjector automatico Drummond Nanoinject II. Iniettare ~ 30 ovociti per ciascuna serie di esperimenti. Dopo l'iniezione TRPV4-cRNA, incubare gli ovociti nel medio ND96 con gentamicina (100 ug / ml) e 1 mM rosso rutenio ^14.

2. Due elettrodi di tensione morsetto

1. Tirare borosilicato pipette di registrazione vetro dalla precisione monouso Micropipette 100 microlitri individualmente con un estrattore pipetta.
2. Pull sia la tensione di misura ed elettrodi pipette correnti-iniezione sono tirato avere un'apertura punta di circa 1 micron di diametro.
3. Elettrodi recupero informazioni con 2 M KCl conseguente 0,1-0,2 resistenza mW. Li montano sul headstages HS2A, che insieme ad un virtuale di messa a terra clamp bagno VG-2Ax100, sono collegati ad una interfaccia amplificatore GeneClamp 500 attraverso un Digidata 1440 digitalizzatore. Acquisire dati utilizzando il software pClamp10.
4. Mettere l'ovocita da testare in un bagno di 1 ml in una camera di plastica fabbricato montato sul palco di un microscopio da dissezione con 20X di ingrandimento. La soluzione del bagno è virtuale a terra da un ponte agar 3 M KCl e un filo di argento clorurato collocati in prossimità del ovocita e collegato ad una fase terra virtuale VG-2A.
5. Costruire la camera di perfusione continua con tubi di plastica come soluzione di ingresso e di uscita. Collegare il tubo di ingresso è collegato ad un sistema di perfusione fabbricato, che è un collettore di sei conchiglie siringa 50 ml, riempiti ognuno con una soluzione differente. Velocità di avanzamento di gravità di qualsiasi soluzione particolare è controllato da ~ 2-3 ml / min con fascette di rampa "Keck" sui tubi.
6. Montare entrambi gli elettrodi con i loro headstages su micromanipolatori. Eseguire penetrazioni degli elettrodi l'ovocita da micromanipolazione.

3. Patch Clamp Esame della diretta mechanosensitivity

1. Riempire pipette in vetro borosilicato con una ~ 1 micron apertura del diametro in punta (numero bolla 5-6) con 98 mM KCl, 1 mM MgCl _2, e 10 mM K ^+-HEPES, pH 7.2.
2. Fissare la pipetta patch clamp attraverso un tubo di plastica per una siringa da 5 ml e attraverso un giunto a T, anche ad un manometro. Utilizzare un computer per gestire sia l'elettrodo e le uscite manometro. Acquisire dati a 10 kHz, e quindi riprodurre attraverso un filtro a otto poli Bessel a 1 kHz per l'analisi.
3. Patch differenti possono essere asportati dallo stesso ovocita ripetutamente. Questa pratica rende l'esame delle attività molecolare di TRPV4 più efficiente e affidabile.

In un tipico esperimento luminometria, una serie di 400-1,200 mOsm shock ipotonici non si raggiunge con l'aggiunta di 200 ml di soluzione d'urto di diversa bassa osmolarità a 20 ml di cultura a 1.400 mOsm. L'attività TRPV4 è evidente quando il RLU della disposizione sperimentale è confrontata con quella di due controlli negativi: cellule di lievito trasformate con il plasmide p416GPDV4 vuoto o uno che contiene il gene TRPV4 con una mutazione nel filtro di ioni (Figura 1) ^24.

In un esperimento tipico voltage-clamp a due elettrodi, gli ovociti sono inizialmente immersi in una soluzione isotonica scorre bagno contenente (in mM) 66 KMeSO _4, 1.8 Ba (meso _{4) 2,} 5 K ^+-HEPES (pH 7,2) e 100 sorbitolo. Correnti di picco sono valutati al termine di 100 impulsi di prova msec a +20 mV da un potenziale di -20 mV ogni 10 sec possesso. Per ottenere risposte ipotoniche flusso viene modificato in una soluzione simile carente sorbitolo. T la sua risposta ipotonica è reversibile dopo la restituzione del sorbitolo e bloccabile dal PRT-canale rosso rutenio (Figura 2A).

In un tipico esperimento patch clamp, viene utilizzata la soluzione simmetrica, cioè la soluzione bagna la patch e la soluzione-pipetta riempimento sono uguali (98 mM KCl, 1 mM MgCl _2, e 10 mM K ^+-HEPES, pH 7,2). Qui, la patch inside-out asportato da un'espressione ovocita ratto-TRPV4 è tenuto a +50 mV. Impulsi di aspirazione sono generati dalla siringa. Brevi aspirazioni, centinaia di msec di durata, applicate a decine di mm Hg, suscitare il ~ 40 pS conduttanza unitaria nativo alla membrana dell'ovocita ³⁷ e il ~ 90 pS conduttanza unitaria del TRPV4 eterologamente espresso (Figura 2B) ^14.

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Figura 1. Rat TRPV4 espressa in lievito rispondere a shock ipotonico. (A) Un diagramma che mostra i metodi sperimentali. (B) Uno shock ipotonico 750 mOsm (teste di frecce) innesca un forte aumento luminescenza (in unità di luminescenza relativa, RLU) in trasformanti TRPV4, ma non in trasformanti di un plasmide vuoto, o plasmide recante un TRPV4 con una mutazione nel suo filtro a ioni (M680K). (C) una relazione dose-risposta tra shock ipotonico e la risposta di picco (media + SD, n = 3). Misure da 2.4 x 10 ⁶ cellule ogni ^24. Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita .

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Figura 2. Esami elettrofisiologici di attività TRPV4 eterologamente espressi ovociti di Xenopus. (A) risposte macroscopiche corrente interi-ovocita a stimoli ipotonici esaminati con un morsetto di tensione a due elettrodi. Correnti di picco da un ovocita che esprimono livelli molto elevati di wild-type TRPV4 (5 giorni dopo l'iniezione di 40 ng di cRNA) su 100 gradini di tensione msec (da -20 a +20 mV ogni 10 sec) (nel riquadro) in risposta alla rimozione di sorbitolo 100 mm dal soluzione di 250 bath mOsm (bar aperti) e l'aggiunta di 3 micron rosso rutenio (RUR, riempito bar). Evidente sono i picchi correnti ripetuti aumenti su stimoli ipotonici e le sue variazioni in diminuzione su il ritorno di soluzione fisiologica o l'aggiunta del bloccante dei canali (RUR). (B) l'attivazione diretta di wild-type TRPV4 dal tratto membrana visto sotto una patch clamp. Un campione di tracce prime di qualità media da una patch asportato da un ovocita-TRPV4 expreesssing, mostrando activazione da 60 aspirazione mmHg (traccia inferiore) applicato ad una patch inside-out asportato tenuto a +50 mV. La traccia più in alto viene visualizzata in una base di tempo più veloce per mostrare il passaggio di corrente unitaria tra chiuso (C) e due livelli aperti (O ₁ e O ₂₎ ^14. Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita .

Come indicato nella Premessa, i metodi comunemente usati per studiare le funzioni TRPV4 talvolta portato a incongruenze e controversie. Le due serie di metodi qui descritti offrono alcuni vantaggi e possono integrare i metodi esistenti. Mentre si descrivono solo gli studi sulla TRPV4, i metodi possono essere estesi a studiare altri canali ionici pure.

1. Metodi di lievito luminometria

Lievito in erba ha un nativo di Ca ^{2 +-risposta} afflusso allo shock ipo-osmotico che è sensibilizzata da mutazioni che colpiscono composizione lipidica ^30. Questo segnale può essere cancellato con EGTA esterno. Questo chelante, tuttavia, non cancella il segnale dal TRPV4 eterologhi espressi ^24, che indica che il canale è espresso in una membrana interna, molto probabilmente quella del reticolo endoplasmatico, da cui il Ca ^{2 +} viene rilasciato nel citoplasma sulla osmotica shock. Traffico di eterologamente espressocanali non sono state studiate in lievito. Se questo metodo essere estesa allo studio di altri canali TRP o altri canali mechanosensitive putativi, il test chelazione deve svolgere e la presenza del sistema nativo tener presente.

2A. Due elettrodi di tensione morsetto

Diversamente l'esperimento patch clamp, l'esperimento voltage-clamp a due elettrodi viene effettuata su ovocita intatta, prima della rimozione della membrana vitellina. Sia l'esame microscopico e valori di capacità indicano che la membrana plasmatica non è uniformemente sferica, ma è alta invaginato sotto la sfera relativamente inelastica della busta vitellina. Così, lo stress meccanico causato dalla hyponicity non è semplicemente una tensione inflazionistica isotropo di una membrana plasmatica sferica espanso. Lo stress probabili risultati dalla spremitura della membrana contro la busta di vincolo vitellino e / o lontani dal gruppo citoplasmatica stabilito in the di fronte a un aumento della pressione osmotica.

Espressione di TRPV4, e probabilmente alcuni altri canali, è tossico per l'ovocita, presumibilmente a causa di Ca ^{2 +} perdite. È quindi importante incubare continuamente l'ovocita dopo l'iniezione TRPV4-cRNA in presenza del-antagonista, rosso rutenio. Il grado di espressione TRPV4 mostra variabilità, che non è completamente sotto controllo sperimentale. Canali TRPV4 mutanti, quelli che mostrano significativa apertura spontanea, vengono sistematicamente espressi precocemente dopo l'iniezione rispetto ai loro wild-type controparte ²³ "guadagno di funzione".

2B. Patch Clamp

Xenopus ovocita esprime un canale nativo meccanosensibili, che rettifica in direzione verso l'interno (~ 50 pS verso l'interno, ~ 10 pS verso l'esterno). Uno studio suggerisce che è l'espressione di TRPC1 ^37. Questo canale nativo costantemente espresso prevede una calibrazione per TRPV4, eteroespressione logous quali non può sempre essere osservato con successo a chiazze.

La probabilità di incontrare TRPV4 tende ad essere maggiore in ovociti dopo un periodo di incubazione più lungo, tipicamente 3-4 giorni dopo l'iniezione cRNA. Un modo efficace di procedere è quello di eseguire prima l'esperimento a due elettrodi-voltage-clamp (sopra), facendo in modo che l'ovocita sta esprimendo la spontanea TRPV4 corrente macroscopica, e quindi procedere a rimuovere la membrana vitellina prima di prendere le patch di esempio dalla stessa ovocita. La probabilità di catturare le attività TRPV4 può essere migliorata utilizzando "macropatches", montati su pipette con fori più grandi (numero bolla 6-7). Fuoco lucidatura queste pipette ³² sembra essere utili a raggiungere il sigillo GΩ. Dopo la formazione sigillo, la patch asportato può mostrare una resistenza molto elevata, molto poco rumore di solito associato alle membrane biologiche, e nessuna attività nativo-canale. Questo probabilmente indicates una formazione doppia membrana. Una breve esposizione all'aria, dal transitoriamente sollevando la pipetta sopra il menisco da micromanipolazione di solito può rompere lo strato supplementare indesiderato. In alternativa, lo strato esterno può essere rimosso sfiorando il foro pipetta contro un filo di guarnizione in silicone indurito sospesa nel bagno.

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.

Vorremmo ringraziare Andrea Kremsreiter per l'eccellente assistenza tecnica. Il lavoro nel nostro laboratorio è supportato da NIH GM096088 e Vilas fiducia della University of Wisconsin - Madison.