PRP come un nuovo approccio per prevenire l'infezione: Preparazione e

Impianto infezioni correlate all'assistenza è una complicazione clinico significativo. Questo studio descrive un approccio con plasma ricco di piastrine (PRP) per prevenire infezioni associate all'impianto, presenta il protocollo per la preparazione di PRP con costante concentrazione piastrinica, e riporta le proprietà antimicrobiche recentemente identificate di PRP e protocolli correlati per esaminare tali proprietà antimicrobiche In vitro.

Impianto associata infezione sta diventando sempre più difficile per il settore sanitario in tutto il mondo a causa della crescente resistenza agli antibiotici, la trasmissione di batteri resistenti agli antibiotici tra gli animali e gli esseri umani, e gli elevati costi di trattamento delle infezioni.

In questo studio, si fornisce una nuova strategia che può essere efficace nel prevenire infezioni associate impianto basato sulle proprietà antimicrobiche potenziali di plasma ricco di piastrine (PRP). Grazie alle sue ben studiate le proprietà per promuovere la guarigione, PRP (un prodotto biologico) è stato sempre più utilizzato per applicazioni cliniche compresa la chirurgia ortopedica, chirurgia parodontale e orale, interventi chirurgici maxillo-facciale, chirurgia plastica, medicina dello sport, ecc

PRP potrebbe essere un'alternativa avanzata ai tradizionali trattamenti antibiotici nella prevenzione impianto-infezioni associate. L'uso di PRP può essere vantaggioso rispetto ai tradizionali trattamenti antibiotici SInce PRP è meno probabile di indurre resistenza agli antibiotici e PRP antimicrobica e di guarigione che promuovono le proprietà possono avere un effetto sinergico sulla prevenzione delle infezioni. È ben noto che gli agenti patogeni e cellule umane sono corse per superfici implantari, e PRP proprietà di promozione della guarigione potrebbe migliorare attaccamento cellulare umana riducendo le probabilità di infezione. Inoltre, PRP è intrinsecamente biocompatibile e sicuro e libero dal rischio di malattie trasmissibili.

Per il nostro studio, abbiamo selezionato diversi ceppi clinici di batteri che si trovano comunemente nelle infezioni ortopediche e valutato se PRP ha proprietà antimicrobiche in vitro nei confronti di questi batteri. Abbiamo preparato PRP utilizzando un approccio doppio centrifugazione che permette la stessa concentrazione piastrinica da ottenere per tutti i campioni. Abbiamo raggiunto risultati consistenti antimicrobici e ha scoperto che ha una forte PRP nelle proprietà antimicrobiche in vitro contro i batteri come methicillin-sensibili e meticillino-resistente Staphylococcus aureus, Streptococcus gruppo A, e Neisseria gonorrhoeae. Pertanto, l'uso di PRP può avere il potenziale per prevenire l'infezione e ridurre la necessità di costosi trattamento post-operatorio di impianto infezioni associate.

Implant-associata infezione è una complicazione clinico significativo. Staphylococcus aureus (S. aureus) è uno dei più comuni microrganismi isolati da protesi infezioni associate. È in grado di produrre un biofilm che riveste le superfici degli impianti e può portare ad antibiotico-resistente ^1,2 infezione. Trattamento delle infezioni correlate all'assistenza dell'impianto richiede spesso una lunga ospedalizzazione per debridements ripetuta e prolungata terapia antibiotica parenterale. In casi resistenti agli antibiotici, la rimozione dell'impianto può essere necessario. La resistenza crescente dei batteri agli antibiotici è stato di cui dai Centers for Disease Control and Prevention (CDC) come "uno dei problemi sanitari più urgenti del mondo." Nel tempo, senza lo sviluppo di nuovi trattamenti antimicrobici ed efficace, è possibile che agenti patogeni multiresistenti sarà non trattabile con antibiotici convenzionali. Prevenzione di impianto associatoinfezione è quindi importante e nuovi agenti profilattici o approcci sono necessari per prevenire tali infezioni.

Plasma ricco di piastrine (PRP) è una concentrazione di sangue autologo che contiene più di 30 fattori di crescita che può aiutare con innesto osseo e la guarigione ossea ^3-5. L'applicazione di PRP per migliorare la rigenerazione ossea e maturazione dei tessuti molli è stato sempre riportato in clinica a causa della sua alta concentrazione di vari fattori di crescita rilasciati dalle piastrine.

Molte caratteristiche di PRP PRP indicano che può anche avere proprietà antimicrobiche ^6-9. PRP contiene un gran numero di piastrine, una elevata concentrazione di leucociti (che può possedere host-difesa azioni contro batteri e funghi), e più peptidi antimicrobici ^7,8,10. In un recente studio di una coorte di pazienti chirurgici cardiaci, è stato rivelato che l'uso intraoperatorio di PRP-gel durante la chiusura della ferita significativamente ridotto l'incidenza di infezione dello sterno superficiale e profondo ^11. Per queste ragioni e osservazioni, abbiamo ipotizzato che PRP, oltre alle sue ben studiate che promuovono la guarigione proprietà, ha proprietà antimicrobiche. I potenziali vantaggi di utilizzare PRP per prevenire l'infezione possono includere: (i) PRP è meno probabile indurre resistenza rispetto ai tradizionali trattamenti antibiotici. (Ii) PRP ha anche proprietà che favoriscono la guarigione, che possono avere un effetto sinergico sulla prevenzione delle infezioni; PRP di guarigione che promuovono le proprietà potrebbe fornire una tenuta per prevenire la fissazione batterica riducendo così le probabilità di infezione da agenti patogeni e cellule umani fanno a gara per superfici implantari ^{12 , 13.} (Iii) PRP è intrinsecamente biocompatibile e sicuro e libero dal rischio di malattie trasmissibili.

Il nostro obiettivo a lungo termine è quello di utilizzare PRP come un nuovo approccio per prevenire impianto associato infections. Lo scopo di questo studio era di preparare PRP utilizzando un approccio centrifugazione due volte, per esaminare PRP in vitro proprietà antimicrobiche, e descrivere i protocolli per la valutazione di tali proprietà antimicrobiche.

1. Preparazione e attivazione di PRP

1,1 Sangue pareggio

1. Anestetizzare coniglio per inalazione di isoflurano (2% O ₂ per l'induzione e l'1% per la manutenzione).
2. Disegnare 2 ml 0,129 M citrato trisodico (una soluzione anticoagulent) in una siringa da 20 ml. Il tri-sodio citrato soluzione viene preparata sciogliendo 1,897 g di citrato trisodico in 50 ml di H ₂ O distillata e filtraggio con un filtro 0,22 micron sterile.
3. Sterilizzare l'orecchio di coniglio con etanolo al 70%.
4. Prelevare il sangue (ad esempio 5 ml) dalla vena auricolare di coniglio attraverso un ago a farfalla (25 G) collegato alla siringa.
5. Mescolare il sangue con il tri-sodio citrato agitando con prudenza. Il rapporto in volume di sangue e tri-sodio citrato è 9:1.

1,2 PRP preparato (Figura 1)

1. Trasferire il sangue con anticoagulante in un tubo da centrifuga da 50 ml in plastica. Prelevare un 'aliquota di 10 microlitrisangue per determinare la conta piastrinica basale, utilizzando hemocytometry.
2. Centrifugare il sangue a 300 xg per 10 min a temperatura ambiente (RT) in una centrifuga con rotore oscillante. Impostare la velocità di accelerazione e frenata a bassa (Figura 1).
3. Dopo centrifugazione, il sangue viene separato in tre strati. Lo strato inferiore è globuli rossi principalmente, lo strato intermedio (comunemente denominato "buffy coat") è composta di piastrine e leucociti concentrati, e lo strato superiore è principalmente plasma, che è la componente liquida del sangue, e piastrine ( la figura 1). Cura il trasporto del tubo da centrifuga ad una cappa di coltura cellulare, non disturbare gli strati. Trasferire tutto il plasma, buffy coat, e 2-3 mm di spessore rosso strato di cellule del sangue in una provetta da 15 ml di plastica con una pipetta 1 ml in plastica.
4. Centrifugare il campione trasferita una seconda volta a 3000 xg per 15 minuti a RT. Lo strato superiore (surnatante) è considerato plasma povero di piastrine (PPP) und viene trasferito in una nuova provetta.
5. Ottenere PRP regolando la concentrazione piastrinica nel campione di sangue rimanente utilizzando PPP per ottenere 2,0 x 10 ⁶ piastrine / microlitro (determinato dal hemocytometry).

1,3 PRP attivazione

1. Preparare soluzione di attivazione PRP disciogliendo 5000 IU trombina bovina con 5 ml di cloruro di calcio al 10% alla concentrazione di lavoro di 1000 IU / ml.
2. Aggiungere la soluzione di attivazione di PRP e PPP, e mescolare la soluzione di pipettare ripetutamente per formare PRP e PPP-gel. Il rapporto in volume della soluzione di attivazione di PRP o PPP è 1:4.

2. In Test antimicrobica in vitro mediante saggio di PRP Curve Kill (Figura 2)

1. Utilizzando un'ansa sterile da inoculo, aggiungere numerose colonie di S. aureus dalla piastra di coltura durante la notte in 5 ml di brodo Mueller Hinton (MHB) in un tubo di plastica. Vortex brevemente e incubare il campione per 2 ore a 37 ° C. Prossimo, La densità ottica dei media batteriche è stata determinata utilizzando uno spettrofotometro e regolato ad una densità ottica pari a ~ 1 x 10 ⁸ UFC / ml in base al predeterminato curva standard.
2. Effettuare una diluizione 100x utilizzando PBS per ottenere 1 x 10 ⁶ UFC / ml e posizionare le inoculums su ghiaccio.
3. Impostare e etichettare sterili, monouso da 5 ml a fondo tondo provette di polistirene, e preparare i gruppi di esempio seguenti, come indicato nella Tabella 1 per un volume finale di 2 ml in ciascun tubo.
4. Aggiungere PRP, PPP, o PBS prima ai tubi di polistirene, seguita dalla soluzione di trombina per l'attivazione (formazione di gel). Successivamente, aggiungere MHB e poi la S. inoculums aureus (1 x 10 ⁶ CFU / ml) per ottenere la concentrazione finale di 1 x 10 ⁵ CFU / ml.
5. Incubare le provette a 37 ° C con agitazione orbitale a 150 rpm.
6. A predeterminati intervalli di tempo (ad esempio 0, 1 e 2 ore), mescolare le soluzioni in ogni tubo attraverso pipettaggio ripetizione (questopasso è importante poiché i batteri possono essere intrappolati all'interno del gel PRP). Prelevare 10 ml di campione, diluire serialmente con soluzione salina allo 0,9%, e pipettare un'aliquota di 100 ml di ciascuna diluizione su un Tryptic Soy Agar (TSA, con sangue di montone al 5%), piastra per il conteggio delle CFU.
7. Cultura piastre di agar notte a 37 ° C, quindi contare e registrare le colonie della piastra. Traccia di dati in una scala logarithimic con il tempo (ora) sul asse x e CFU / ml l'asse y.

PRP è riproducibile preparato utilizzando un approccio di centrifugazione due volte (Figura 1). PRP è trovato presentare una forte (fino a 100 volte riduzione CFU) in vitro proprietà antimicrobiche contro resistente alla meticillina S. aureus (MRSA) (Figura 3), che si trova comunemente negli ospedali in tutto il mondo ^14. Allo stesso modo, PRP ha forti proprietà antimicrobiche contro sensibili alla meticillina S. aureus (MSSA), streptococco di gruppo A, e Neisseria gonorrhoeae.

L'approccio centrifugazione due volte consente l'acquisizione di PRP con la stessa concentrazione di piastrine (cioè 2,0 x 10 ⁶ piastrine / microlitro) ma concentrato (~ 10 volte sopra la linea di base di sangue; Figura 4) e consente di ottenere risultati coerenti antimicrobici; differenze significative risultati in CFU tra PRP da diversi singoli animali (vale a direconigli) sono state osservate.

Tabella 1. Campioni sperimentali per la valutazione antimicrobica di PRP.

Figura 1. PRP preparato mediante un procedimento di centrifugazione due volte. (A) prima centrifugazione. Dopo la prima centrifugazione, tre strati sono formati, e le prime due strati (cioè plasma e strati di buffy coat) e 2-3 mm dello strato inferiore (cioè strato globuli rossi) vengono trasferite ad un secondo tubo da centrifuga sterile. (B) In secondo luogo la centrifugazione. Dopo la seconda centrifugazione, lo strato superiore viene trasferito in una nuova provetta sterile e designate come PPP. Il rimanente viene regolata con PPP ad una concentrazione piastrinica di 2,0 x 10 ⁶ piastrine / microlitro e designate come PRP.

Figura 2. Set-up sperimentale per la valutazione della antimicrobica properties del PRP utilizzando il saggio uccidere curva. Innanzitutto, PRP o PPP viene aggiunto alle provette, e immediatamente attivato con soluzione di trombina. Successivo, MHB viene aggiunto seguito da inoculums batteriche. Aliquote di campioni vengono prelevati in momenti diversi e placcato per una conta.

Figura 3. PRP, PPP, o PBS sono posti in una provetta sterile 5 ml polistirene con trombina, MHB brodo e MRSA inoculo e quindi incubate a 37 ° C con agitazione orbitale a 150 rpm. At predeterminati intervalli di tempo (ad esempio 1 e 2 h), aliquote di prelievo di campioni e placcato per una conta. (A) i dati e le CFU (B) immagini rappresentative piastra di diluizione a 10 ^-2. Significativa riduzione (~ 100 volte in 2 ore) di crescita MRSA si ottiene using PRP rispetto ai controlli PPP e PBS. Questo è vero per i batteri come MSSA, streptococco di gruppo A, e Neisseria gonorrhoeae pure.

Figura 4. Strisci di sangue di sangue intero (sinistra) e PRP (a destra). PRP preparato dal metodo di centrifugazione due volte ha circa 10 volte il numero di piastrine rispetto al sangue intero.

Plasma ricco di piastrine è stato sempre più utilizzato per applicazioni cliniche grazie alle sue proprietà di favorire la ^{guarigione-15-17.} Nel presente studio, PRP è stato presentato come un nuovo approccio per la prevenzione delle infezioni. PRP è stato trovato per avere forti proprietà antimicrobiche contro MRSA, MSSA, streptococco di gruppo A, e Neisseria gonorrhoeae. I vantaggi principali di PRP, rispetto ai tradizionali trattamenti antibiotici, per la prevenzione delle infezioni sono: (1) Le attuali terapie antibiotiche si trovano ad affrontare sfide sempre più segnalati tra cui la resistenza agli antibiotici ^14,18-20. PRP potrebbe essere una alternativa avanzata in quanto (i) PRP di proteine ​​piastriniche microbicida può possedere proprietà chemiotattica per le cellule immunitarie come i neutrofili, i monociti e le cellule T che giocano un ruolo importante nella difesa contro l'invasione degli agenti patogeni ^21, e (ii) rispetto agli antibiotici convenzionali, piastrine proteine ​​microbicidi sono meno inclini a inducing resistenza batterica dovuta alla difficoltà di modificare le strutture della membrana batterica ^22. (2) PRP non solo riduce le infezioni, ma anche promuovere la guarigione delle ferite, entrambi sono costose in termini di trauma, tempo e denaro.

PRP ha recentemente attirato l'interesse maggiore. Tuttavia, ci sono numerose varianti complesse tra protocolli di preparazione PRP compreso il numero iniziale di piastrine, l'uso di anticoagulanti, l'inclusione di leucociti, e l'utilizzo di attivatori ^23-27. La variazione in preparazione PRP contribuisce in parte ai risultati controversi sia in animali e studi clinici ^28. Come risultato, un grosso problema per studi PRP è di controllare la variazione. In questo studio, un approccio centrifugazione due volte è stato eseguito, e la concentrazione di piastrine PRP è stato fissato a 2 x 10 ⁶ piastrine / microlitro (~ 10 volte sopra la linea di base nel sangue) per standardizzare il protocollo di preparazione PRP e limitare la variabilitàin preparazione PRP. L'approccio presentato centrifugazione due volte è semplice, può essere facilmente applicato per l'isolamento di PRP dal sangue di altri animali e di esseri umani, e ha portato a costante in vitro le proprietà antimicrobiche di coniglio PRP nel presente studio. Tuttavia, le differenze possono ancora esistere poiché i fattori di crescita e altre sostanze chimiche all'interno o rilasciati dalle piastrine possono variare tra singole cellule e animali; alcune popolazioni cellulari (per esempio leucociti) non sono stati controllati. Notare che leucociti ricca PRP è stato preparato e utilizzato in questo studio, poiché leucociti sono coinvolti in diretta uccisione batterica e antigene-specifica risposta immunitaria. I protocolli possono essere ulteriormente modificati per ottenere leucociti poveri PRP effettuando una seconda centrifugazione del solo lo strato superiore (cioè plasma e piastrine porzione) dopo la prima centrifugazione (Figura 1).

In questo studio, 50 ml di sangue intero è stato utilizzato per ottenere circa 5 ml di PRP. Se il volume di sangue è un problema, il sangue da animali pool multipli possono essere usati per preparare PRP. Se forma coaguli durante prelievo di sangue e / o centrifugazione, molto probabilmente alcune piastrine sono attivate che si tradurrà in bassa resa piastrinica. Pertanto, anticoagulanti sufficienti e gentili ma accurata miscelazione sono passi importanti per l'isolamento PRP successo.

PRP è stato attivato con trombina nel presente studio. Altri approcci tra cloruro di calcio, trombina esogena o autologo con o senza cloruro di calcio, stress meccanico (ulteriore centrifugazione ad alta velocità), e batroxobina può essere applicato anche per l'attivazione PRP ^29-32. Si noti che le piastrine attivate dalla trombina possono probabilmente rilasciare il loro contenuto granuli molto più veloce di piastrine attivate da altre sostanze chimiche. Il motivo è che, oltre alla sua capacità di convertire fattore XI XIa, VIII VIIIa, V a Va, e fibrinogeno in fibrina, trombina può promuovere l'attivazione e aggregazione piastrinica mediantectivation di proteasi attivate recettori sulle membrane cellulari piastrine ^33-35.

Il saggio è stato presentato curva uccisione per valutare l'attività antimicrobica in vitro di PRP. A differenza del test di diffusione su agar disco, il saggio curva uccisione permette la valutazione quantitativa della percentuale di attività battericida nel tempo. Un passo fondamentale per disperdere adeguatamente batteri quando il conteggio CFU è quello di mescolare l'intera cultura accuratamente pipettando vigoroso prima che il campione viene prelevato e vortex per diluizioni seriali, come PRP gel possa confondere la propria capacità di disperdere correttamente i batteri.

Nel complesso, plasma ricco di piastrine ha forti proprietà antimicrobiche contro batteri come S. aureus, streptococco di gruppo A, e Neisseria gonorrhoeae. Oltre alle ben studiate che promuovono la guarigione proprietà, PRP può servire come un nuovo approccio per prevenire le infezioni associate all'assistenza impianto. Il meccanismo di proprietà antimicrobiche PRP è sfino indagini sconosciuti e in seguito in questo settore sono necessari.

Le limitazioni di questo studio comprendono PRP che non elimina completamente i batteri nelle nostre condizioni sperimentali (1 x 10 ⁵ CFU / ml). Ciò può essere dovuto alla virulenza dei ceppi batterici clinici che sono stati utilizzati, 1 x 10 ² CFU (0,1 ml) di S. aureus indotta infezioni gravi in vivo ^36-38. In alternativa, la quantità di PRP può essere aumentata per ottenere migliore eliminazione batterica, o PRP può essere usato insieme con la somministrazione sistemica o locale di antibiotici convenzionali per la prevenzione dell'infezione, il doppio effetto (cioè antimicrobica e promuovono la guarigione-proprietà) di PRP può essere vantaggioso nel promuovere la guarigione, mentre prevenire l'infezione. Un altro limite è che il PRP non deve essere usato per i pazienti che sono già stati infettati per via sistemica (ad esempio, pazienti con sepsi). Questo perché i batteri nel sangue può essere passareed a partire da PRP al sito di applicazione, a meno tecniche di sterilizzazione adeguate. Si consiglia un attento esame delle possibili contaminazioni batteriche di PRP prima del suo utilizzo.

Gli autori dichiarano di non avere conflitto di interessi finanziari.

Gli autori ringraziano Therwa Hamza, John E. Tidwell, Nina Clovis, e Suzanne Smith per l'assistenza sperimentale e Suzanne Smith per la correzione. Gli autori hanno anche ringraziare John Thomas, PhD per fornire gli isolati batterici clinici e John B. Barnett, dottorato di ricerca per il suo sostegno e l'uso del laboratorio di sicurezza biologica presso il Dipartimento di Microbiologia, Immunologia e Biologia Cellulare presso la West Virginia University. Gli autori riconoscono il sostegno finanziario della osteosintesi e Trauma Care Foundation e la National Science Foundation (# 1003907). Esperimenti di microscopia e analisi di immagine sono stati effettuati nel Fondo per la West Virginia University Imaging, che è supportato in parte dal Babb Mary Randolph Cancer Center e sovvenzione del NIH P20 RR016440.

Uso degli animali per i prelievi di sangue sono stati approvati dalla cura degli animali Occidentale Virginia University e del Comitato Istituzionale uso. Tutti gli esperimenti sono stati eseguiti in conformità a tutte le Linee guida per l'pertinenties, regolamenti, e agenzie di regolamentazione.