Misurazione della tattile Allodinia in un modello murino di prostatite batterica

L'infezione della prostata può essere un fattore che contribuisce a mediare dolore pelvico in prostatite cronica. Descriviamo la procedura per la preparazione di standard inoculo batterico, l'instillazione di batteri nell'uretra di topi maschi e la metodologia per la misurazione allodinia tattile nei topi nel corso del tempo.

Uropatogeni Escherichia coli (UPEC) sono agenti patogeni che svolgono un ruolo importante nelle infezioni delle vie urinarie e prostatite batterica ^1. Abbiamo recentemente dimostrato che UPEC hanno un ruolo importante nell'avvio di dolore pelvico cronico ^2, una caratteristica di prostatite cronica / sindrome dolorosa pelvica cronica (CP / CPPS) ^3,4. L'infezione della prostata da parte UPEC clinicamente rilevante in grado di avviare e definire il dolore cronico attraverso meccanismi che possono comportare danni ai tessuti e l'avvio di meccanismi di autoimmunità ^5.

Una sfida per comprendere la patogenesi della UPEC nella prostata è relativa inaccessibilità della prostata alla manipolazione. Abbiamo utilizzato un metodo precedentemente descritto infezione intrauretrale ⁶ per fornire un ceppo clinico di UPEC in topi maschi stabilendo, quindi un'infezione ascendente della prostata. Qui, descriviamo i nostri protocolli per uniformare le bacterial inoculo ⁷ nonché la procedura per la cateterizzazione anestetizzati topi maschi per instillazione di batteri.

CP / CPPS è principalmente caratterizzata dalla presenza di allodinia tattile ^4. Test comportamento era basato sul concetto di iperalgesia cutanea risultante da cui ^8-10 dolore viscerale. Un focus irritabile nei tessuti viscerali riduce la soglia del dolore cutaneo che consentano una risposta esagerata al normalmente non dolorosi stimoli (allodinia). Applicazione della forza normale al risultato pelle in risposte anomale che tendono ad aumentare con l'intensità del dolore viscerale sottostante. Descriviamo metodologia in NOD / ShiLtJ topi che utilizzano fibre di von Frey quantificare allodinia tattile nel tempo in risposta ad una singola infezione con batteri dell'UPEC.

1. Preparazione per l'inoculo batteri mouse

Devono essere effettuata in condizioni asettiche.

1. Prendere una 17 x 100 provette di polipropilene mm con tappi e aggiungere 3 ml di brodo fresco Luria (LB) media. Con punte autoclave, prendere un po 'congelato stock in glicerolo batteri del ceppo CP1 ² e trasferire una piccola quantità della cultura nella provetta contenente il supporto LB. Sostituire il tappo del tubo in modo che l'ossigeno è ancora in grado di entrare nel tubo - la cultura ha bisogno di crescere in condizioni aerobiche. Tubo a 37 ° C in un incubatore agitazione a 220 rpm overnight.
2. Il giorno successivo, trasferire 5 ml di coltura durante la notte in una nuova provetta con supporti ml 3 LB e crescere in condizioni statiche in un incubatore notte a 37 ° C.
3. Il giorno 3 di trasferimento 40 microlitri della cultura in aa tubo da 50 ml contenente 40 ml ciascuno dei media LB. Mettere in una notte a 37 ° C statico incubatore.
4. Accendere e impostare centrifuga a 4 ° C.Una volta che ha raggiunto la temperatura centrifuga finale, trasferire ogni 40 ml di coltura in una provetta da centrifuga 40 ml Nalgene.
5. Pesare tubi per bilanciare centrifuga - regolare il volume con i media LB, se necessario. Spin tubi a 6.000 rpm per 20 min.
6. Rimuovere con attenzione il surnatante e delicatamente sospendere pellet batterico in 40 ml di PBS sterile.
7. Ripetere il punto 1.5 con PBS.
8. Aspirare il surnatante e sospendere off batteri in 500 microlitri di PBS sterile. Trasferire la soluzione in una provetta da microcentrifuga 1,5 ml. Prelevare 10 ml di sospensione e diluire in 990 ml di ghiacciata PBS. Usare uno spettrofotometro per leggere le OD _{420 nm} per determinare il volume necessario per inoculazione. Per determinare il volume appropriato di ghiacciata PBS di sospendere pellet in: Prendere l'OD _{420 nm} numero (in ml) e sottrarre il volume stimato del pellet batterico [es. OD _{420 nm} = 0,545, pellet di circa 0,075 ml. 0,545-0,075 = 0,470].
9. Rimuovere 10 pl di sospensione di batteri e diliuto nel 990 microlitri ghiacciata PBS. Leggi le _{nm 420} OD. L'obiettivo è quello di raggiungere un valore di _nm OD ₄₂₀ per la sospensione diluita di 1.000 ± 0,010. Se il numero della diluizione è al di sopra di tale obiettivo, aggiungere più volume alla sospensione e prendere un'altra lettura. Se il numero è inferiore al 0,990 poi centrifugare la sospensione e ripetere la lettura OD _{420 nm} fino ad ottenere lettura desiderata.

2. L'infezione degli animali

Mice (5-7 settimane di vita, dieci per gruppo) sono stati acquistati dalla Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME).

1. I topi vengono anestetizzati per inalazione del 1-4% isoflurano in una camera di plexiglas e sono controllati fino a quando reclinata.
2. Un mouse alla volta viene preso per instillazione di batteri tramite cateterismo con polietilene (PE10) catetere attaccato ad un ago 30 G modificata di una siringa Hamilton vetro (lunghezza di 1,5-2,0 cm). Il catetere viene inserito al mozzo dell'ago. Il mouse è placed sulla sua superficie dorsale in anestesia mantenute usando un cono.
3. Il pene del mouse viene estrusa con una leggera pressione e la quantità di lubrificante liberali su tamponi di cotone viene utilizzato per la lubrificazione di l'ingresso dell'uretra peniena.
4. 10 pl di PBS contenente 1 x 10 ⁸ batteri viene introdotto nell'uretra di topi anestetizzati dopo cateterizzazione.
5. I topi vengono mantenuti in uno stato anestetizzato per 15 min nella camera plexiglas dopo introduzione batterica per consentire attacco batterico e di prevenire la minzione immediata.
6. I topi vengono rimesse nelle loro gabbie e monitorato per le successive 24 ore.

3. Comportamento Test

I topi sono stati testati prima dell'infezione (basale) e nei giorni 3, 7, 14, 21 e 28 dopo l'infezione. Cui iperalgesia e allodinia tattile è stato testato utilizzando von Frey filamenti applicato sull'addome ^11,12 e il r plantareEgion della zampa posteriore ^13. Il test è stato perfomed in un determinato momento della giornata, metodologia standard e test sperimentatore unico di tutti gli animali sono stati impiegati. Accecato test dei gruppi è stato utilizzato per combattere le limitazioni di comportamento basato su test del dolore in modelli animali. Cinque filamenti singoli von Frey con forze di 0,04, 0,16, 0,4, 1,0 e 4,0 g (Stoelting, USA) sono stati applicati al ventre e frequenza delle risposte ritiro è stato calcolato.

1. Dopo un periodo di 30 minuti di acclimatazione, i topi sono posti in camere singole plexiglas (6 x 10 x 12 cm) realizzati in casa con un pavimento in acciaio griglia di filo di acciaio.
2. Riferito iperalgesia e allodinia tattile sono stati testati utilizzando i cinque filamenti di von Frey. Ogni filamento è stato applicato per 1-2 sec con un inter-stimolo intervallo di 5 secondi per un totale di 10 volte, ed i peli sono stati testati in ordine crescente di forza.
3. Ogni filamento è applicato alla zona addominale inferiore in prossimità generale della prostata ecura è stata presa per stimolare diverse aree all'interno di questa regione per evitare di desensibilizzazione o "liquidazione" effetti. Filamenti sono stati applicati in ordine crescente di forza per 1-2 secondi con intervalli di almeno 5 secondi tra stimoli per un totale di 10 volte.
4. Tre tipi di comportamento sono considerati una risposta positiva alla stimolazione filamento: 1) retrazione acuto dell'addome; 2) leccare immediata o graffiare dell'area di stimolazione filamento; 3) salto.
5. Risposta in frequenza è stata calcolata come percentuale di risposta positiva (di 10, ad esempio 5 risposte di 10 = 50%) e di dati è stata riportata come percentuale media di risposta in frequenza ± SE
6. Animali con più di 25 risposte positive totale basale sono esclusi dallo studio.
7. Allodinia tattile è stato testato sulla regione plantare della zampa posteriore con filamenti di von Frey con le forze di 0,04, 0,16, 0,4, 1,0 e 4,0 g. La soglia media di ritiro al 50% (5) è stata valutata utilizzando il up-downmetodo in cui è stato avviato il test con 0,04 g filamento applicata perpendicolarmente alla superficie plantare della zampa posteriore finché il filamento leggermente piegate. Filamenti sono stati testati in ordine ascendente fino una risposta positiva è stata osservata. Una risposta positiva al filamento è stata definita come un brusco ritiro della zampa o leccare della zampa test. Quando una risposta positiva è stata registrata successivo filamento più debole è stato applicato, e se una risposta negativa è stata osservata, quindi il successivo filamento forte è stato applicato.
8. Gli esperimenti e le metodologie descritte sono stati esaminati e approvati dalla cura degli animali Northwestern University e utilizzare comitato.

Abbiamo esaminato topi NOD / ShiLtj e maschi C57BL/6J per la presenza di dolore cronico dopo infezione batterica. Topi maschi (5 a 7 settimane di età) sono stati instillati con soluzione salina o batteri nell'uretra (Figura 1). Stimolazione meccanica della zona pelvica con von Frey filamenti di soluzione salina-instillato topi C57BL/6J e UPEC topi infettati C57BL/6J portato ad una risposta in frequenza che non è cambiato durante i 28 giorni di corso dell'esperimento (Figura 1). In contrasto, UPEC infettati topi NOD esposto risposte alla stimolazione pelvica che erano significativamente maggiori e rimasto significativamente elevato fino al giorno 28 (P <0,05; Figura 3). Infezione batterica comportato alcuna variazione sensibilità tattile della regione plantare della zampa posteriore (dati non mostrati).

tp_upload/50158/50158fig1.jpg "/>
Figura 1. Diagramma di flusso sperimentale. 1 x 10 ⁸ batteri preparato da una tre giorni di cultura è stato sospeso in PBS e instillato nell'uretra di topi anestetizzati da cateterismo. Risultante allodinia tattile è stata quantificata utilizzando filamenti di von Frey con le forze di 0,04, 0,16, 0,4, 1, e 4 g.

Figura 2. Metodologia per la verifica allodinia tattile utilizzando fibre di von Frey. Topi sono stati testati prima infezione batterica e post-infezione giorni (PID) 7, 14, 21, e 28. Tre diversi tipi di comportamento sono stati considerati come risposte positive alla stimolazione filamento: 1) forte retrazione del ventre 2) leccare immediata o graffiare della zona di stimolazione filamento o 3) salto. Risposta frequente è stato calcolato come la percentuale di risposta positiva (su 10) e data sono stati riportati come la percentuale media di risposta in frequenza ± SE.

Figura 3. Allodinia tattile indotta dai batteri UPEC. Riferito iperalgesia viscerale è stata misurata come risposte alla stimolazione meccanica della regione pelvica con filamenti di von Frey di cinque forze calibrate. I dati sono riportati come media delle percentuali di risposte positive ± SE prima della instillazione di batteri (basale) e PIDs 7, 14, 21, e 28. ANOVA indicato un aumento significativo della risposta in frequenza a PIDs 7-28 rispetto alla linea di base che per tutti i filamenti testati in UPEC infettati topi NOD (P <0,05). La risposta per cento a ogni PID è stato calcolato come risposte a tutte le fibre totali relativi alle risposte di base.

Infezione della prostata mouse con UPEC consente la modellazione in vivo di eventi che possono essere coinvolte nella patogenesi della prostatite batterica, CP / CPPS o come un evento predisponente infiammazione cronica. I metodi descritti per la preparazione di batteri e instillazione pareggio su un vasto corpo di letteratura sui modelli UPEC nelle infezioni del tratto urinario femminile ^7,14. Il modello dispone di ampia applicabilità per studiare la patogenesi, la sperimentazione vaccini candidati potenziali e dei meccanismi di modulazione immunitaria. La capacità di seguire il comportamento dolore in modo quantificabile consente lo studio di infezione indotta patogenesi dolore e potenzialmente come modello preclinico per testare terapie dolore.

Ci sono diversi passaggi critici che determinano il successo del modello di infezione mouse. I tre giorni metodo di coltura con agitazione e culture statici viene eseguita per l'espressione ottimale di pili che sono noti per essere importanti per UPECattaccamento alle cellule epiteliali. Esso rappresenta un passo fondamentale per la colonizzazione da parte degli organi di successo UPEC. Le tecniche per la crescita batterica sono stati progettati specificamente per la crescita UPEC con il passo OD ₄₂₀ ottimizzato per ottenere 10 ml di PBS contenente 1 x 10 ⁸ batteri ^7. Altre specie o ceppi di batteri potenzialmente crescere a ritmi diversi e la standardizzazione sarebbe importante per ricavare il diametro esterno adeguato che dà 1 x 10 ⁸ batteri. Diversi ceppi di batteri aderire alle cellule della vescica e della prostata in modi unici che sono largamente dipendenti dai fattori di virulenza espressi dal ceppo ^14. Infezione successo della prostata murino sarebbe quindi dipende utilizzo di un ceppo UPEC con il complemento appropriato di fattori di virulenza. Immediatamente dopo l'infezione, mantenendo gli animali in uno stato leggermente anestetizzati per un minimo di 15 minuti è importante garantire che insbatteri coltivati ​​in tempo a collegare e avviare patogenesi prima che i normali meccanismi della minzione cancellare il volume da infondere dall'uretra.

Allodinia tattile in topi è una conseguenza del sottostante patologia viscerale e come tale è caratterizzato da specificità squisita ceppo ospite. Abbiamo descritto in precedenza che un ceppo patogeno di UPEC in NOD maschio / topi ShiLtJ induce allodinia che i picchi in 3 giorni ed è sostenuta cronicamente, mentre lo stesso ceppo non è in grado di indurre in allodinia C57BL/67 topi ^2. I nostri studi suggeriscono UPEC indotta accelerazione dei processi autoimmuni nella NOD / ShiLtJ topi come la causa di fondo. Così lo sfondo ospitante genetica è importante nello sviluppo di allodinia tattile. Altri passi importanti che sono fondamentali per una misurazione imparziale e di successo di allodinia garantiscono che il tester è sempre accecato all'identità del trattamento, il tester stesso è responsabile per la misura di tutti i tempi-pUNTI nell'esperimento, utilizzo di tempi di test simili durante il giorno, condizioni di stabulazione dei topi e garantendo condizioni standardizzate sia all'interno punti temporali in un esperimento così come tra esperimenti.

Il modello di infezione murino ha una serie di limitazioni che devono essere attentamente considerati durante l'interpretazione dei risultati. Batteri instillato intraurethrally hanno la capacità di infettare la vescica e la prostata. Questo complica l'interpretazione di eventuali parametri sistemici o generali come la patologia potrebbe essere da più organi. Tuttavia, l'utilizzo di ceppi clinici e prostata derivati ​​batterici nonché esame concorde della vescica e la prostata permette interpretazioni appropriate. Inoltre, la metodologia di infezione simula modalità probabile un'infezione ascendente nei maschi umani.

Il modello di infezione qui descritto differisce da quelli precedentemente riportati pripalmente nel ceppo di UPEC utilizzato, il ceppo ospite mouse e differenze nelle tecniche di coltura ⁶ e il volume di batteri instillato nell'uretra ^15. Il presente studio utilizza un ben caratterizzato derivato prostata cronica ceppo UPEC prostatite per mediare malattia ^2. Studi precedenti hanno utilizzato batteri derivati ​​da infezioni della vescica o prostatite acuta che è stato utilizzato principalmente per eventi infiammatori associati esame ma non caratterizzato in termini di allodinia tattile ^6,15. Numerosi altri modelli animali sono stati segnalati che utilizzano meccanismi autoimmuni ^{5,16, 17} manipolazione ormonale e thymectomies neonatali ¹⁸ a indurre prostatite. Mentre ciascuno di questi modelli hanno alcune caratteristiche positive, tra cui la malattia patologia organo-specifiche e l'utilizzo di tecniche di pre-esistenti la rilevanza di questi metodi per la patogenesi effettivo di CP / CPPS è sconosciuto. Al contrario, il metodo descritto in questo uomouscript si riferisce ad un meccanismo di potenziale che è stato postulato per essere un iniziatore della patogenesi della malattia nella prostata. Inoltre, al di là della sua utilità per la comprensione CP / CPPS patogenesi, le tecniche potrebbero essere utilizzati per stabilire e di esaminare l'infiammazione cronica della prostata e il suo ruolo nel BPH (iperplasia prostatica benigna) e il cancro alla prostata.

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Questa ricerca è stata sostenuta da sovvenzioni 1K01DK079019A2 (PT) dal NIH / NIDDK.