Isolamento e la coltura di miofibre individuali e delle loro cellule satelliti da adulto muscolo scheletrico

L'isolamento e la cultura della miofibre è il gold standard In vitro per studiare la transizione delle cellule satelliti attraverso quiescenza, l'attivazione e la differenziazione. Soprattutto, l'unico sistema di coltura miofibre preserva la miofibre / stelo associazione cella, che è un componente essenziale della nicchia delle cellule staminali muscolari.

Rigenerazione muscolare nell'adulto viene eseguita da cellule staminali residenti chiamate cellule satelliti. Cellule satellite sono definite dalla loro posizione fra la lamina basale ed il sarcolemma delle miofibre ciascuna. Le attuali conoscenze del loro comportamento si basa molto sull'utilizzo del protocollo unico di isolamento miofibre. Nel 1985, Bischoff descritto un protocollo per isolare singole fibre vivi dalla digitorum Flexor Brevis (FDB) di ratti adulti con l'obiettivo di creare un sistema in vitro in cui è conservata l'associazione fisica tra il miofibre e le cellule staminali ^1. Nel 1995, il protocollo Rosenblattmodified Bischoff tale che miofibre vengono prelevati singolarmente e manipolati separatamente dopo digestione con collagenasi invece di essere isolato mediante sedimentazione gravitazionale ^{2, 3.} Il Rosenblatt o Bischoff protocollo è stato poi adattato per diversi muscoli, età o condizioni ^3-6. Il singolo tecnica di isolamento miofibre è indispensabilestrumento grazie i suoi vantaggi unici. Primo, nel singolo protocollo miofibre, cellule satelliti sono mantenute sotto la lamina basale. Questa è una caratteristica unica del protocollo, come altre tecniche come la fluorescenza activated cell sorting richiedono chimica e meccanica dei tessuti dissociazione ^7. Anche se il sistema di coltura miofibre non possono sostituire gli studi in vivo, esso offre una piattaforma eccellente per affrontare le pertinenti caratteristiche biologiche delle cellule staminali muscolari. Miofibre singoli possono essere coltivate in condizioni standard o placcatura in condizioni galleggianti. Le cellule satellite su miofibre galleggianti sono sottoposti a pratica nessun effetto diverso l'ambiente miofibre. Rigidità substrato e rivestimento hanno dimostrato la capacità di influenzare le cellule satelliti di rigenerarsi muscoli ^{8, 9} in modo da essere in grado di controllare ciascuno di questi fattori permette indipendentemente discriminazione tra nicchia-dipendente e-indipendenti risposte. Diverse concentrazioni di siero hannoanche dimostrato di avere un effetto sulla transizione dalla quiete per l'attivazione. Per mantenere lo stato di quiescenza delle sue cellule satellitari correlati, le fibre devono essere tenuti in condizioni di scarsa media siero ^1-3. Ciò è particolarmente utile quando si studiano i geni coinvolti nello stato di quiescenza. Nel siero terreno ricco, le cellule satellite attivare rapidamente, proliferano, migrano e si differenziano, quindi imitando il processo nel vivo rigenerativo ^1-3. Il sistema può essere utilizzato per eseguire una varietà di saggi quali il test di inibitori chimici; espressione ectopica di geni di consegna virus; oligonucleotide gene basata knock-down o imaging vivo. In questo articolo il video descrive il protocollo attualmente in uso nel nostro laboratorio per isolare singole miofibre dal estensore lungo delle dita (EDL) muscolo di topi adulti (6-8 settimane).

Tutti gli esperimenti sono stati trattati secondo l'Università di regolamenti di Ottawa per la cura degli animali e la gestione.

Vedi Tabella 1 per una panoramica del protocollo.

1. Prima di avviare l'isolamento

1. Preparare le seguenti soluzioni:
   Collagenasi di tipo I 0,2% in DMEM (Dulbecco modified Eagle medium; glucosio, L-glutammina, con 110 mg / ml di piruvato di sodio). Per due muscoli EDL preparare 2 ml di 0,2% Collagenease in DMEM. Filtrare la soluzione attraverso filtro 0,22 micron. 10 minuti prima l'isolamento, preriscaldata a 37 ° C in un bagno d'acqua. Aliquote supplementari collagenasi non diluito può essere congelato a -20 ° C per un uso successivo.
   Nota: utilizzare DMEM con piruvato di sodio in tutta la procedura. Fibre non sopravvivono in sodio piruvato terreno privo.
   • Mezzi di lavaggio (utilizzare per eseguire tutti i lavaggi). Supplemento DMEM con 1% di penicillina / streptomicina. Filtrare su 00,22 micron filtro prima dell'uso.
   • Miofibre cultura dei media. Supplemento DMEM con 20% FBS, 1% estratto di embrioni di pollo e 1% di penicillina / streptomicina. Filtrare su filtro 0,22 micron prima dell'uso.
   • Matrigel piatti rivestiti. Per le fibre di cultura per lungo periodo di tempo, si consiglia di utilizzare come substrato Matrigel rivestimento. Per preparare piatti rivestite Matrigel, scongelare un'aliquota di Matrigel a 4 ° C per una notte. Il giorno dopo, Matrigel diluire 1:10 in DMEM. Tenere Matrigel a 4 ° C in ogni momento e di evitare sbalzi termici come questo creerà microscopici cristalli all'interno del Matrigel soluzione risultante non uniforme. Piatti posto da rivestire su ghiaccio. Piatti Cappotto con volume appena sufficiente a coprire la superficie. Lasciate riposare per 1 minuto. Rimuovere completamente il Matrigel residuo. Lasciate asciugare i piatti a 37 ° C per almeno 3 ore prima dell'uso o durante la notte.
   
   Nota: aliquote di Matrigel diluita può essere riutilizzato più volte per fini rivestimento, se conservati a 4 & deg; C.
2. Infine, assicurarsi di pulire la stazione di microscopio e strumenti di dissezione con il 70% di etanolo.
3. Per due isolamenti EDL (un mouse) preparare cinque piatti di plastica Petri (60 * 15mm) come segue:
   • Quattro piatti per l'isolamento (1 per il muscolo dissociazione, 3 per lavaggi seriali). Tutti i piatti devono essere protette con siero di cavallo (HS) per evitare miofibre di attaccarsi alla plastica. Per cappotto, Pipettare 3 ml di siero di cavallo in ogni ricciolo piatto, per consentire anche rivestimento, rimuovere il siero di cavallo e lasciare il piatto asciugare per almeno 30 min. Aggiungere 4 ml di DMEM ad ogni piatto. Mantenere piatti a 37 ° C in 5% CO ₂ incubatore prima dell'uso.
   
   Nota: siero di cavallo può essere riutilizzato più volte, se mantenuto sterile. In alternativa, una soluzione del 10% in DMEM HS può essere usata per rivestire i piatti. Usare piatti HS rivestite in tutto l'intero protocollo e quando miofibre coltura sulle condizioni di galleggianti.
   • Un piatto sarà utilizzato per miofibre coltura dopo l'isolamento. Altdimensioni della parabola ernative o formati può essere utilizzato per la coltura finale di miofibre seconda applicazioni a valle. Tuttavia, non suggeriscono dimensioni della parabola di dimensioni superiori a 60 * 15 mm. Miofibre possono essere mantenute in sospensione per non più di 96 ore prima contrazione iper verifica. Per tempi più lunghi della cultura, si consiglia di utilizzare Matrigel piatti rivestiti o piastre.
4. Per un isolamento in fibra (2 EDL), preparare due pipette Pasteur sterili: una pipetta di grande diametro per la manipolazione dei muscoli e una pipetta di piccolo diametro per la manipolazione delle miofibre. Utilizzare una penna di diamante per tagliare ogni pipetta di vetro per la lunghezza desiderata e lucidare il calore per lisciare pipetta bordi. Mediante la fiamma, curva la punta della pipetta di piccolo diametro. Questo vi aiuterà a gestire singole fibre. Fiamma per sterilizzare. Cappotto ogni pipetta con HS prima dell'uso.

2. Dissezione muscolare e digestione

1. Ai fini di questi esperimenti, 8 settimane di età SV129, Pax7 créer ^Cklr; Rosa26TdTomato (Pax7Cre-TdTomato) e Myf5-Cre; Rosa26YFP sono stati utilizzati.
2. Spruzzare arti posteriori con il 70% di etanolo. Pin l'animale (faccia in su) ad un forum di supporto per avere una migliore comprensione del dell'arto posteriore durante la procedura.
3. Con l'aiuto di forbici, tagliare l'intera lunghezza dell'arto e esporre il muscolo sottostante. Togliere la pelle così come tutti i capelli o pelliccia (Figura 1A).
4. Con una forbice fine, tagliare la fascia sottile senza danneggiare i muscoli sottostanti. Visivamente localizzare l'EDL. L'EDL si trova nel vano anteriore della dell'arto posteriore appena sotto il tibiale anteriore (TA) muscolare.
5. Con l'aiuto di due pinze, esporre i tendini distali.
6. Tagliare i tendini distali (sia del TA e EDL) con taglienti Cohann-Vännäs forbici a molla.
7. Con l'aiuto di pinze da contenere sia TA e dei muscoli EDL dai loro tendini e delicatamente tirare i muscoli verso l'estremità prossimale. A questo punto dovreste essere in grado di vedere chiaramenteil muscolo EDL proprio sotto il muscolo TA. Ora, separare il EDL dal muscolo TA tirando i due tendini in direzioni opposte (figura 1B). Evitare di stiramento del muscolo EDL durante l'esecuzione di questa operazione per evitare di danneggiare le miofibre.
8. Esporre il tendine EDL. Per visualizzare meglio il tendine prossimale può contribuire a questo punto per rimuovere il muscolo TA. Esso può anche aiutare a tagliare un po 'di tessuto connettivo del tutto il ginocchio (Figura 1C).
9. Tagliare il tendine prossimale e rimuovere delicatamente la EDL (Figura 1D).
10. Tenendo il muscolo attraverso i tendini, trasferirlo in 2 ml di soluzione di collagenasi precedentemente preparata. Incubare a 37 ° C in un bagno d'acqua.
    Nota: per l'isolamento in fibra di successo, è importante isolare il EDL da tendine a tendine in modo che l'integrità delle miofibre viene mantenuta. Passi 2,3-2,9 può essere eseguita sotto un microscopio da dissezione. In alternativa, l'uso di un magnficare vetro può anche aiutare ad avere una visione migliore dei muscoli.
11. Ripetere i passaggi 2,3-2,9 per isolare la EDL secondo. Trasferire la EDL secondo nel tubo stesso. Per evitare la digestione irregolare, isolamento della EDL secondo dovrebbe essere completato non più di 5 minuti dopo la prima.
    Nota 1: il tempo di incubazione può essere necessario modificare a seconda dell'attività collagenasi. Incubazione più lungo o più corto potrebbe essere necessario a seconda dell'età dimensioni, e / o condizione muscolare (ad esempio, i muscoli fibrotici bisogno di tempo di digestione più lungo).
    Nota 2: Se l'esame satellitare comportamento delle cellule in condizioni di quiescenza, durante il tempo di agitazione muscolare digestione possono attivare le cellule satelliti ^10.
12. Durante il tempo di digestione, controllare regolarmente il muscolo per evitare un eccesso di digestione. Arrestare la digestione quando i muscoli cominciano a rilassarsi e miofibre sono visibili. Per arrestare la digestione, trasferire accuratamente entrambi i muscoli ad un piatto preriscaldato Petri con 4 ml di DMEM (dissociatisul piatto). Usare la pipetta grande diametro per eseguire questa operazione.
    Nota: evitare di overdigestion muscolare come questo inevitabilmente comporta l'isolamento di iper miofibre contratto.

3. Singolo miofibre Dissociazione e Cultura

1. Per rilasciare miofibre, utilizzare la pipetta di vetro di grandi dimensioni foro per irrigare il muscolo con il mezzo caldo fino a quando le fibre naturalmente iniziano ad essere rilasciato. Non triturare il muscolo in quanto ciò si tradurrà inevitabilmente in fibre dannose. Eseguire questa e le seguenti operazioni sotto un microscopio da dissezione.
2. Continua il rilascio miofibre finché il numero desiderato. Se il piatto è richiesto a temperatura ambiente per più di 10 min consentire un 5 min (minimo) incubazione a 37 ° C, 5% di CO ₂ di riequilibrare il mezzo.
   Nota: se il prodotto raggiunge temperature inferiori fisiologica (37 ° C) per un periodo di tempo prolungato miofibre morirà.
3. Con le piccole dimensioni del foro pipetta, transfer vivere miofibre singole per un nuovo piatto preriscaldato (primo di tre lavaggi consecutivi). Gestire ogni miofibre singolarmente invece di trasferire maggior parte delle miofibre tutto in una volta. Se necessario, incubare a 37 ° C, _5% CO2 per 10-15 min a riequilibrare il mezzo.
4. Ripetere il punto 3.3 per altre 2 volte o fino a quando tutte le miofibre morti e detriti vengono rimossi. Si consiglia almeno tre lavaggi consecutivi per una corretta pulizia.
   Nota: miofibre morte apparirà come breve e iper contratta sotto la luce microscopio.
5. Incubare miofibre singole a 37 ° C, 5% di CO ₂ nel piatto ultimo lavaggio (DMEM solo) per almeno un ora prima del passaggio a mezzo di coltura. Ciò consente di regolare miofibre alla condizioni in vitro in assenza di siero. Abbiamo scoperto che la cultura immediata di miofibre nel siero terreno ricco di fibre aumenta il restringimento.
6. Dopo un ora, trasferire miofibre di un nuovo piatto preriscaldato o nel formato appropriato culturaa seconda dell'applicazione a valle. Fibre di cultura in alta media siero per consentire l'attivazione delle cellule satellite. In alternativa, diverse concentrazioni di siero o embrione di pollo estratto può essere utilizzato. Cambiare mezzo ogni altro giorno.

4. Applicazioni a valle

1. Immunostaining. Miofibre vivi possono essere fissate e colorate in qualsiasi punto nel tempo durante l'isolamento. Immunofluorescenza può essere eseguita su miofibre sia galleggianti e substrato collegata. Se la colorazione miofibre galleggianti, usare una pipetta di vetro piccolo foro per trasferire miofibre da una soluzione ad un'altra. In alternativa, è possibile mantenere miofibre nello stesso pozzo in tutta la procedura e aggiungere / rimuovere soluzioni utilizzando una pipetta di vetro. Evitare aspirazione standard come questo comporta la rimozione delle miofibre pure. In breve, rimuovere completamente terreno di coltura; miofibre fix preriscaldato in paraformaldeide 4% (PFA) per 5 min. Ampiamente lavare in PBS più volte. Incubazionemiofibre te in 1% glicina in PBS o altre soluzioni standard di tempra per minimizzare la colorazione di fondo PFA. Se necessario, permeabilize miofibre con 0,1% Triton X-100 in PBS per 10 min seguito da un lavaggio in PBS 5 min. Incubare le fibre in una soluzione bloccante (10% siero di cavallo, 0,1% Triton X-100, 1% NaN) per 1 ora a temperatura ambiente o preferibilmente durante la notte a 4 ° C. Soluzioni alternative di bloccaggio possono essere utilizzati, a seconda del anticorpo di interesse. Lavare una volta in PBS per 5 min. Incubare con l'anticorpo primario diluito in una soluzione bloccante per 1 ora a temperatura ambiente o per una notte a 4 ° C. Lavare le fibre 3 volte a 5 minuti a lavaggio in PBS per rimuovere qualsiasi anticorpo non legato. Incubare con l'appropriato anticorpo secondario per 45 minuti a 1 ora a temperatura ambiente. Lavare 3 volte in 5 minuti per lavaggio in PBS. Controcolorare nuclei con 1 mg / ml DAPI. Se la colorazione delle fibre flottanti, trasferire ciascuna fibra ad un vetrino adatto per microscopia. Eliminare l'eccesso di PBS o media. Applicare montaggio medium e quindi aggiungere il coprioggetto. Procedere per visualizzare miofibre sotto un microscopio a fluorescenza. Vedere la Figura 4 per immunofluorescenza rappresentante a miofibre EDL. Procedure di colorazione alternativi utilizzando forti fissativi sono descritti in Verma, M. et al. ¹¹ e Wosniak, CA et al. ^12.
2. Oligonucleotide o plasmide trasfezione transiente. Miofibre Live possono essere trasfettate con siRNA plasmide o per specifico gene / s di interesse. Quando si utilizza siRNA, trasfezione doppio è consigliato per knockdown gene efficiente. Si consiglia di eseguire la trasfezione prima volta dopo 8 ore dall'isolamento. Sei ore dopo la trasfezione, sostituirlo con terreno fresco. Per la trasfezione siRNA, suggeriamo partenza utilizzando una concentrazione finale di 50 nM. Espressione knockdown gene può essere analizzata mediante estrazione dell'RNA o preferibilmente mediante immunocolorazione.
3. Infezione virale. Infezione di miofibre vivi è possibile anche se l'incidenza di cellamorte è superiore a trasfezione con oligo e l'efficienza di infezione può essere variabile a seconda delle condizioni muscolari ed età. Per esempio, intatte miofibre muscolari adulti non sono particolarmente sensibili alle infezioni virali per la presenza della lamina basale, che ha dimostrato di fornire una barriera protettiva contro le infezioni ospite ^{13, 14.} Vettori lentivirali sono da preferire rispetto vettori retrovirali in quanto possono infettare le cellule quiescenti (non mitotico). Per l'infezione virale, si consiglia di fibre di cultura su un piatto rivestito Matrigel o targa e lasciare miofibre adeguarsi alle condizioni del supporto per le prime 24 ore.
4. Vivo Imaging. Vivo imaging di miofibre è particolarmente lunga e richiede un microscopio dotato di 37 ° C, 5% di CO ₂ camera. È utile per valutare il comportamento di singole cellule satelliti. Il lavoro svolto con questa tecnica è stato determinante per la scoperta di eterogeneità delle cellule satellite e studiare la loro BehaVior su fibre (15 e 16).

Qui abbiamo descritto l'isolamento di singole miofibre dal muscolo EDL di topi adulti. Miofibre di successo resa dipende da diversi fattori, come l'attività collagenasi o condizioni muscolari o di età. Soprattutto, l'isolamento del muscolo da tendine a risultati tendinee in lunghe miofibre intatte dal muscolo EDL. Figura 1 mostra un passo dalla rappresentazione grafica del passo "tendine tendine" isolamento. Una volta che il muscolo è completamente digerito, miofibre vengono rilasciati applicando una leggera pressione al muscolo. Figura 2A mostra un quadro rappresentativo di un esperimento di isolamento miofibre dopo il primo lavaggio. A questo punto la cultura contiene una miscela di fasci di miofibre singoli che appaiono come strutture tubolari lunghi e lucenti, iper contratta miofibre, che sono scuri e corti e detriti dal processo di digestione. Alla fine di almeno tre lavaggi consecutivi, solo miofibre singoli vivi devono rimanere nella dish per cultura o analisi a valle (Figura 2B). Figura 2C mostra una fibra lunga e vivo rispetto a una fibra iper contratta (C '). Al momento della separazione, appaiono come cellule satelliti protuberanze piccoli sulla superficie delle miofibre (Figura 3A). Se mantenute in terreno ricco di siero, cellule satelliti attivare, proliferare, migrare e infine fondersi in miotubi (B). Dopo 15 giorni di coltura, tutti i miotubi esprimere il reporter Myf5 YFP (C), suggerendo che la rigenerazione muscolare nell'adulto viene eseguita da cellule che ad un certo punto durante il loro sviluppo aveva espresso il fattore determinante miogenico Myf5. Tutte le cellule satelliti esprimono il fattore di trascrizione associato casella Pax7 ^17. La linea topo giornalista Pax7Cre-TdTomato può essere usato per tracciare cellule satelliti tramite l'espressione del segnale TdTomato fluorescente (Figure 3D ed E). Figura 4 mostra una immu rappresentantenofluorescence di doppio Pax7 + / cellule satellite MyoD. Classicamente doppia Pax7 + / MyoD + cellule satelliti sono considerati proliferative progenitori muscolari impegnati che o completare il programma di differenziazione verso il basso regolando Pax7 mantenendo un'espressione MyoD o ritorno in quiescenza dal basso regolando MyoD e mantenere Pax7 espressione ¹⁸

Figura 1. Isolamento del muscolo EDL di topo arti posteriori. A. Arti posteriori di un topo adulto 8 settimana fa. Le frecce indicano il distale (ginocchio) e il tendine prossimale (piede) tendine. B. Posizione anatomica del tibiale anteriore (TA) e il muscolo estensore lungo delle dita (EDL) muscolare. C. Tenendo il EDL attraverso il tendine prossimale, il muscolo è tirato verso il ginocchio per esporre il tendine distale. D. Il tendine distale ètagliare e EDL viene rilasciato.

Figura 2. I risultati rappresentativi di un singolo esperimento di isolamento miofibre. A. Immagine Campo chiaro di un esperimento di isolamento miofibre nella fase primo lavaggio. Freccia rossa indica miofibre dal vivo, freccia bianca indica iper miofibre contratto e freccia gialla indica cellule, miofibre o detriti ECM. B. Dopo lavaggi consecutivi in DMEM, solo miofibre rimangono vivi. C e C '. Immagine rappresenta una lunga intatta vivo miofibre (C) e una iper breve contratta miofibre (C '). Bar 10 micron. Le foto sono state scattate con un microscopio Zeiss Axio Observer Z1 dotato AxioCam HR.

Figur e 3. I risultati rappresentativi di un singolo esperimento cultura miofibre. A. Immagine Campo chiaro di un unico, miofibre in tempo reale con la sua cellula satellite corrispondente (freccia) subito dopo l'isolamento (tempo 0). B. Miofibre singole sono state piastrate su Matrigel e coltivate in terreno ricco siero per 15 giorni. Freccia bianca indica miotubi differenziati rispetto a singole cellule (freccia gialla) C. Miofibre singole a partire da un Myf5Cre; topo RosaYFP sono state coltivate come in B. La freccia indica Myf5 miotubi derivati. D e E. Miofibre singoli da Pax7Cre; TdTomato sono state isolate e fissate subito dopo. Le frecce indicano Pax7 cellulare positiva satellite quiescente (E, rosso). I nuclei sono stati colorati con DAPI (D). Bar: 50 micron. Le foto sono state scattate con un microscopio Zeiss Axio Observer Z1 dotato AxioCam HR.

Tabella 1. Panoramica del protocollo di isolamento delle miofibre. Isolamento miofibre Il protocollo è costituito da 4 fasi principali. Per ogni passo, il tempo approssimativo e le principali criticità sono discussi. Per una discussione dettagliata di ogni passaggio, fare riferimento al testo del protocollo.

L'isolamento e la coltura di singole miofibre di muscoli intatti fornisce un eccellente modello in vitro per studiare il processo di rigenerazione muscolare. Una caratteristica unica di questo sistema è la conservazione di cellule satelliti nel loro ambiente fisiologico sotto la lamina basale. Soprattutto, la tecnica può essere usato per studiare il comportamento delle cellule muscolari staminali sia quiescenza e stati attivati. Negli ultimi 20 anni, il sistema cultura miofibre ha fornito indicazioni significative sulla biologia della popolazione di cellule satellite rispetto ad entrambi determinanti intrinseci ed estrinseci. Da miofibre singoli coltura, eterogeneità cellula satellite rispetto al miofibre, tipo di muscolo o potenziale rigenerativo è stato affrontato ^15. Elaborare studi che utilizzano l'imaging dal vivo di singole fibre coltivate consentiti per ottenere le informazioni sul modello di migrazione delle cellule satellite ^16. L'acquisizione dei dati quantitativi èLSO possibile. Anche se richiede tempo, fornisce informazioni significative sulla distribuzione e verificarsi di eventi specifici (cellule staminali asimmetrico rapporto di divisione, proliferazione e differenziazione, ecc). Insieme con applicazioni precedentemente descritte, proteina o l'estrazione di RNA da singole fibre è anche possibile, sebbene isolamento di popolazione pura di cellule satelliti da FACS o altri mezzi possono fornire una migliore piattaforma per analizzare le variazioni di espressione della proteina o del gene a livello molecolare. Nella nostra esperienza, la fase più critica per l'isolamento in fibra di successo è il "tendine a tendine" isolamento (passi 2,5-2,9 nel testo del protocollo). Questo garantisce che, dopo la digestione muscolari, fibre vengono rilasciati dalla EDL con minimo danno o no aumentando così le loro prestazioni nei seguenti passi.

Non ci sono interessi in gioco.

Vorremmo ringraziare Sarah Dick per la fornitura di lettura critica e commenti. MAR detiene il Canada Research Chair in Genetica Molecolare ed è un Research Scholar Internazionale del Howard Hughes Medical Institute. Questo lavoro è stato sostenuto dalle concessioni al MAR dal National Institutes of Health, l'Howard Hughes Medical Institute, il Canadian Institutes of Health Research, l'Associazione distrofia muscolare e il programma di ricerca del Canada presidente.