Legatura del cieco procedura di puntura

Il modello murino di legatura del cieco e la puntura come un prezioso strumento per lo studio della sepsi umana.

Sepsi umana è caratterizzata da una serie di reazioni sistemiche in risposta alle infezioni intensiva e massiccia che non è riuscito a essere contenuta a livello locale da parte dell'ospite. Attualmente, si colloca sepsi tra le prime dieci cause di mortalità nelle unità di terapia intensiva Stati Uniti ^1. Durante la sepsi ci sono due fasi stabilito emodinamico, che potrebbero sovrapporsi. La fase iniziale (iperdinamica) è definita come una massiccia produzione di citochine proinfiammatorie e le specie reattive dell'ossigeno da parte dei macrofagi e neutrofili che colpisce la permeabilità vascolare (porta a ipotensione), la funzione cardiaca e induce cambiamenti metabolici si conclude con necrosi dei tessuti e insufficienza d'organo. Di conseguenza, la causa più comune di mortalità è danno renale acuto. La seconda fase (hypodynamic) è un anti-infiammatorio processo che coinvolge alterato dei monociti presentazione dell'antigene, diminuzione della proliferazione dei linfociti e la funzione e l'apoptosi aumentata. Questo stato conosciuto come l'immunosoppressione o la depressione immunitaria aumenta nettamente il rischio di infezioni nocosomial e, in definitiva, la morte. I meccanismi di questi processi fisiopatologici non sono ben caratterizzati. Poiché entrambe le fasi di sepsi può causare danni irreversibili e irreparabili, è essenziale per determinare lo stato immunologico e fisiologica del paziente. Questo è il motivo principale per cui molti farmaci terapeutici hanno fallito. Lo stesso farmaco dato a diversi stadi di sepsi può essere terapeutico o comunque nocivi o non hanno alcun effetto ^2,3. Per capire sepsi a vari livelli è fondamentale avere un modello animale adeguato e completo che riproduce il decorso clinico della malattia. E 'importante per caratterizzare i meccanismi fisiopatologici che si verificano durante la sepsi e controllare le condizioni di modello per testare potenziali agenti terapeutici.

Per studiare l'eziologia della sepsi umana ricercatori hanno sviluppato diversi modelli animali. Il modello più diffuso clinica è la legatura del cieco e foratura (CLP). Il modello CLP consiste nella perforazione del cieco che permette il rilascio di materiale fecale nella cavità peritoneale di generare una risposta immunitaria indotta esacerbato da infezione polimicrobica. Questo modello soddisfa la condizione umana che è clinicamente rilevante. Come negli esseri umani, i topi sottoposti a CLP con fluidi mostrano il primo (inizio) di fase iperdinamico che nel tempo avanza al secondo (in ritardo) fase hypodynamic. Inoltre, il profilo delle citochine è simile a quello osservato nella sepsi umana, dove vi è una maggiore apoptosi dei linfociti (recensione a ^4,5). Grazie ai meccanismi molteplici e sovrapposte coinvolti nella sepsi, i ricercatori hanno bisogno di un modello adatto sepsi di gravità controllati al fine di ottenere risultati coerenti e riproducibili.

1. Legatura del cieco e la puntura come un modello murino di sepsi umani

Per questa procedura C57BL / 6 topi (7-9 settimane) sono utilizzati.

1. Anestetizzare il topo mediante iniezione intraperitoneale di una soluzione di 1:1 ketamina (75mg/kg) e xilazina (15mg/kg). Come riferimento, iniettare 30 ml di soluzione 1:01 in un topo peso di 20 grammi. In alternativa, i topi possono essere anestetizzati con isoflurano inalato utilizzando un vaporizzatore anestetico.
2. Shave l'addome del mouse e disinfettare zona da prima soluzione di betadine applicando seguita strofinando con un tampone imbevuto di alcool al 70% (numero 1 nella sequenza di foto qui sotto). Clorexidina può essere usato come antisettico alternativa. Opzionale: una garza sterile può essere utilizzato per mantenere l'area pulita.
3. In condizioni asettiche, pratica un 1-2 centimetri laparotomia mediana ed esporre il cieco con intestino adiacente (2 e 3).
4. Il cieco è strettamente legatura con una sutura di seta 6,0 (6-0 prolene, 8680G, Ethicon) alla sua base sotto la valvola ileo-cecale, ed è forata una o due volte con un 19-gauge (4 e 5) sullo stesso parte del cieco. Si prega di notare che la lunghezza del cieco legatura definita come la distanza tra l'estremità distale del cieco al punto di legatura a determinare il grado di gravità. A distanza di> 1 centimetro produce sepsi alto livello, mentre una distanza di ≤ 1 centimetro produce medio-basso grado di sepsi. Si noti inoltre che con il metodo del cieco perforazione mostrato qui è diversa da quella standard grazie e attraverso la tecnica puntura (introducendo un ago attraverso il cieco). Entrambi i metodi affidabile produrre lo stesso risultato sepsi. Tuttavia, uno svantaggio della tecnica tutto e per tutto è che non facilita il controllo della quantità di feci estruso quando il cieco è spremuto.
5. Il cieco è poi delicatamente spremuta di estrudere una piccola quantità di feci dai siti di perforazione (6). Il cieco è tornato alla cavità peritoneale e il peritoneo è chiuso con 6,0 punti di sutura di seta. (7).
6. La pelle è chiusa con Reflex clip 7mm (RS-9258, Roboz strumenti chirurgici) o clip ferita Michel (7 mm, RS-9270) (8).
7. Resuscitare i topi iniettando per via sottocutanea 1 ml di pre-riscaldato soluzione salina 0,9% utilizzando un ago 25G. Questa misura rianimazione fluido indurre la fase iperdinamica di sepsi. Questa fase critica è descritta ulteriormente nella sezione di discussione.
8. Opzionale: Iniettare per via sottocutanea buprenorfina (0.05 mg / kg di peso corporeo) o tramadolo (20mg/kg di peso corporeo) per la post operatorio analgesia. Essere informati che questi oppiacei possono sopprimere la respirazione e la locomozione e questi effetti possono essere male interpretate come segni di sepsi.
9. Gli animali sono posti temporaneamente su una piastra elettrica o in alternativa immediatamente rigettati in una gabbia con l'esposizione a una lampada di riscaldamento a raggi infrarossi da 150W fino a riprendersi dalla anestesia. Il tempo di recupero è da 30 minuti a 1 ora.
10. Fornire l'accesso libero a cibo e acqua (idrogel), posto sul fondo della gabbia.
11. I topi sono monitorati ogni 12 ore per la sopravvivenza di una o due settimane o eutanasia in diversi momenti per l'analisi di diversi parametri.

Come controllo per il disegno sperimentale, gli animali farsa avrebbe seguito la tecnica laparotomia senza legatura e puntura.
Da sei a 12 ore dopo l'intervento chirurgico topi diventerà letargico e sviluppare febbre, piloerezione, diarrea, stringendosi e malessere; tutti i sintomi di sepsi. I topi con sepsi molto grave riesce a malapena a passare prima della morte e mostrano una drastica riduzione della temperatura corporea. A questo topi passo dovrebbe essere l'eutanasia per evitare il dolore e la sofferenza prolungata.

2. Parametri analizzati più comuni

Per valutare l'esito della procedura, diversi parametri possono essere analizzati in organi, estratti cellulari o fluidi corporei. I campioni possono essere raccolti in diversi momenti da 3 ore a una settimana dopo l'intervento chirurgico.

1. Topi sopravvivenza.
2. Citochine e chemochine nel siero, cavità peritoneale ed estratti d'organo.
   1. Interleuchina-6: Prodotto e distribuito da monociti, le cellule dendritiche, macrofagi, cellule B, cellule T, granulociti, mastociti e molti altri tipi di cellule. Essa svolge un ruolo importante nella reazione di fase acuta e infiammazione.
   2. Fattore di necrosi tumorale-α: Pleiotrophic citochina che svolge un ruolo centrale nei processi infiammatori e l'apoptosi. Prodotto da monociti, macrofagi, i neutrofili, cellule dendritiche e fibroblasti.
   3. nterleukin-1β: Prodotta dai monociti, le cellule NK, cellule dendritiche, cellule B e le cellule T. Induce la febbre e la sintesi delle proteine ​​di fase acuta.
   4. L'interleuchina 10: Promuove l'assorbimento dei fagociti e le risposte Th2, ma sopprime antigit presentazione e risposte Th1 proinfiammatorie.
   5. L'interleuchina 10: Promuove l'assorbimento dei fagociti e le risposte Th2, ma sopprime la presentazione dell'antigene e Th1 risposte proinfiammatorie.
   6. Proteina chemiotattica dei monociti-1 (conosciuta anche come CCL2): reclute monociti, le cellule T di memoria, e le cellule dendritiche a siti di danno tissutale e infezioni.
   7. KC (CXCL1): Prodotta da macrofagi e cellule endoteliali. Topo KC è un attrattivo neutrofili potente e attivatore.
   8. RANTES: un fattore chemiotattico dei monociti. Può chemoattract CD4 + non stimolate / CD45RO + cellule T CD4 di memoria e stimolato + e CD8 + T con ve na e fenotipi di memoria.
   9. Interferone-γ: Secreta dal Th1 delle cellule, le cellule T citotossiche, cellule dendritiche e natural killer (NK). Aumenta la presentazione dell'antigene e l'attività litica nei macrofagi e sopprime l'attività delle cellule Th2. Favorisce l'adesione e vincolante richiesto per la migrazione dei leucociti e promuove l'attività delle cellule NK.
   10. Ad alta mobilità di gruppo B-1 proteina: in monociti è un fattore nucleare kappa B attivatore legandosi al recettore cellulare per i prodotti finali della glicazione avanzata (RAGE), attivando il rilascio di mediatori proinfiammatori in fase tardiva di sepsi.
3. Determinazione mieloperossidasi di organi come misura di infiltrazione dei neutrofili. Mieloperossidasi (MPO) è un enzima perossidasi più abbondantemente presente nei granulociti neutrofili. Si tratta di una proteina lisosomiale memorizzati in granuli azzurrofili dei neutrofili. MPO è un pigmento eme, che causa il suo colore verde nelle secrezioni ricco di neutrofili, come pus e alcune forme di muco.
4. I batteri carico di organi e sangue, misurare il numero di unità formanti colonia per millilitro.

3. Rappresentante Risultati

La procedura di CLP è stato effettuato inizialmente nel ceppo di topi C57BL / 6. Abbiamo testato diversi parametri di modulare la gravità della sepsi modificando la lunghezza della legatura e lo spessore dell'ago come indicato nelle figure 1 e 2. Tra questi due fattori, la lunghezza della legatura sembra essere più efficace rispetto allo spessore dell'ago di modificare la sopravvivenza per cento. Come mostrato nella Figura 1, aumentando la lunghezza della legatura di più di 1 centimetro provoca un aumento della mortalità del 100% rispetto ai topi con una legatura di ≤ 1 cm. Aumentando lo spessore dell'ago ha anche diminuito la sopravvivenza per cento dal 100% (con un ago 22G) al 55% (con un ago 19G) con due forature. Abbiamo anche testato l'effetto del CLP su C57BL / 6 e 129SvJ topi per determinare se differenti ceppi di topi presentano una sensibilità simile o distinti per CLP-indotta la sepsi. La Figura 3 mostra che nelle stesse condizioni, i topi 129SvJ erano più suscettibili alle infezioni rispetto C57BL / 6, indicato da un aumento della mortalità per cento.

Figura 1. Effetto della lunghezza legatura del cieco di sopravvivenza degli animali. CLP è stata eseguita in C57BL / 6 topi utilizzando due diverse lunghezze di legatura del cieco. Questo parametro influenza notevolmente la sopravvivenza degli animali in quanto tutti gli animali del gruppo con una superficie legatura più lunga di 1 cm morti in meno di 3 giorni rispetto a un gruppo di animali aventi una superficie legatura di 1 cm circa. (N = 8).

Figura 2. Influenza dell'ago spessore sulla sopravvivenza. CLP è stata eseguita in C57BL / 6 topi utilizzando due dimensioni ago diverso, 19G e 22G. I topi con il cieco forata con un ago 19G ha mostrato una sopravvivenza a 55-60%. Al contrario, i topi con il cieco forata con un ago 22G ha mostrato il 100% di sopravvivenza, anche se ha manifestato sintomi tipici dell'infiammazione durante i primi 3-4 giorni; che scomparve dopo 4 giorni (n = 8).

Figura 3. Confronto di suscettibilità sepsi tra due diversi ceppi di topi. Il modello CLP è stata eseguita in 129SvJ e C57BL / 6 alle stesse condizioni. Al termine del periodo di valutazione della percentuale di sopravvivenza del ceppo 129SvJ era del 25% in meno rispetto al C57BL / 6 ceppo, indicando una maggiore suscettibilità ad infiammazione indotta da infezione polimicrobica. (N = 6).

Qui vi mostriamo nel dettaglio come eseguire il modello CLP nei topi e modulare il grado di gravità.

Rispetto ad altri modelli animali di sepsi, CLP può essere eseguita in qualsiasi ceppo di topi di differenti età e sesso. Si tratta di una procedura relativamente semplice e poco costoso intervento chirurgico. In questo modello, il grado di gravità ha un impatto diretto sulla percentuale di sopravvivenza. La lunghezza della legatura, lo spessore dell'ago e il numero di punture sono parametri che possono essere controllati per modulare la gravità / mortalità del CLP. Di conseguenza, per ottenere cambiamenti drammatici in gravità CLP, l'utente può modificare la lunghezza della legatura mentre lieve modifica di gravità può essere introdotto regolando lo spessore dell'ago.

Altri parametri importanti che potrebbero introdurre una sostanziale variabilità nei risultati CLP sono il ceppo di topi ^{6,7, 8} e il sesso l'età dell'animale ^9. A questo proposito abbiamo dimostrato che ceppi di topi diversi visualizzare suscettibilità distinti per la procedura se effettuata nelle stesse condizioni. Infatti, le differenze nei livelli plasmatici di citochine e danni ai tessuti sono stati rilevati tra diversi ceppi di topi ^10-12. L'inclusione di fluidi e amministrazione analgesico sono fattori che possono introdurre una significativa variabilità nel modello CLP. Per esempio, la reintegrazione dei liquidi aumenta il tasso di sopravvivenza forse diminuendo la produzione dei primi citochine pro-infiammatorie ^{11, 13, 14} mascherando così gli effetti di eventuali interventi terapeutici. Al contrario, analgesici narcotici può sopprimere la respirazione e la locomozione negli animali e provocare un effetto irreversibile estranei a sepsi. Il loro utilizzo, quindi, possono influenzare il tasso di sopravvivenza e funzione delle cellule immunitarie ^15.

In conclusione, quando si esegue il modello CLP tutte queste condizioni ed i parametri tecnici devono essere attentamente considerati al fine di ottenere risultati riproducibili e coerenti. Di conseguenza, una profonda conoscenza e padronanza della procedura è assolutamente necessario per eseguire il modello CLP precisione.

Questo lavoro è stato sostenuto da un finanziamento della Pennsylvania Department of Health.
Dr. Miguel Garcia Toscano è stato Fellow post-dottorato presso la Temple University, finanziato dalla Fondazione Martin Alfonso Escudero durante questo studio.
Vogliamo ringraziare Iliya Yordanov e Kotredes Kevin per la realizzazione del video.