Sottocutaneo infezione di Staphylococcus aureus meticillino resistente (MRSA)

Murino e morbida pelle modello di infezione dei tessuti viene utilizzato per valutare la funzione di virulenza di S. aureus meticillino-resistente (MRSA) e le risposte immunologiche ospite. Qui, abbiamo presentato un modello di infezione per via sottocutanea per la pelle e le infezioni dei tessuti molli.

MRSA è una minaccia mondiale per la salute pubblica, e la pelle MRSA e dei tessuti molli ora rappresentano più della metà di tutti i tessuti molli negli Stati Uniti. Fra tessuti molli, miosite, pyomyositis, e fascite necrotizzante sono state aumentate le segnalazioni in associazione con MRSA derivanti dalla comunità. Per capire l'interazione tra MRSA e immunità dell'ospite che porta a più gravi infezioni, la disponibilità di modelli animali è fondamentale, permettendo lo studio dei fattori di accoglienza e batterica. Diversi modelli di infezione sono stati introdotti per valutare la patogenesi di S. aureus durante l'infezione superficiale della pelle. Qui, descriviamo un modello di infezione per via sottocutanea che esamina la pelle, sottocutaneo, muscolare e patologie.

1. Preparazione del MRSA per infezione (due giorni prima infezione)

1. Inoculare un'ansata di MRSA da una coltura madre ad un agar sangue (soia-agar (TSA)) piastra.
2. Controllare il fenotipo emolisi (una zona chiara intorno ad ogni colonia) sulla piastra di agar sangue.
3. Scegli una colonia che ha un fenotipo emolitica che è coerente con altri esperimenti.
4. Inoculare la colonia in 3 ml di Todd Hewitt Broth (THB), con l'antibiotico appropriato quando necessario, in un mL 15 snap-provetta.
5. Incubare a 37 ° C per una notte in agitazione a 220 rpm.

2. Preparazione del Mice per infezione (un giorno prima infezione)

1. A seconda delle dimensioni dei topi, accorciare il pelo fuori uno x 3 4 cm sulla superficie posteriore di topi.
2. Applicare ~ 5 mm ³ crema Epilatore (acquistato da un negozio locale di droga) per l'area rasata.
3. Lasciare la crema Epilatore per incubare sulla superficie della pelle per circa 1 min.
4. Tovaglioli di carta bagnati con DDH ₂ O.
5. Togliere la crema Epilatore con il tovagliolo di carta bagnato.

3. Preparazione del MRSA per infezione (nel giorno di infezione)

1. Diluire la coltura batterica durante la notte a 1:500 a 1:1000 con 10 ml di pre-riscaldato THB, in una da 50 ml con tappo a vite del tubo.
2. Incubare a 37 ° C per circa 2,5 ore con agitazione a 220 giri al minuto, fino a raggiungere ₅₄₀ 2.5.
3. Raccogliere MRSA per centrifugazione a 3.225 xg per 10 minuti a 4 ° C.
4. Scartare il surnatante.
5. Risospendere il pellet batterico in 10 ml di fosfato salina tamponata Dulbecco (DPBS).
6. Ripetere i passaggi 3 e 4.
7. Risospendere il pellet batterico in DPBS ad una concentrazione desiderata.
8. Serie diluire la sospensione batterica da ¹⁰ Gennaio - 10 AGOSTO.
9. Piastra la sospensione diluita batterica su piastre di agar sangue.
10. Incubare le piastre a 37 ° C durante la notte.
11. Osservare e registrare il fenotipo emolitica del inoculi.
12. Contare le unità formanti colonia (CFU) il numero sul piatto.
13. Calcola il inoculi in base al numero UFC sul piatto.

4. Sottocutaneo infezione di MRSA (nel giorno di infezione e 3 giorni dopo l'infezione)

1. Iniettare per via sottocutanea 100 microlitri della sospensione batterica nella zona rasata.
2. Osservare gli animali da 3 a 5 ore dopo l'iniezione per assicurarsi che i topi sono vivi.
3. Osservare la lesione sul dorso degli animali e registrare ogni giorno la zona della lesione ogni giorno quando è necessario. Osservazione lesione dovrebbe includere la registrazione di dimensione della lesione e morfologia. Sia la pelle e le lesioni muscolari sono quantificata moltiplicando la lunghezza e la larghezza della lesione. Lesioni di forma irregolare devono essere suddivisi in piccoli pezzi simmetrici, e ogni pezzo misurato con lo stesso metodo. Misure lesione può anche utilizzare un computer-assistita del programma di valutazione istomorfometrica (ImageJ; open-source disponibile presso il NIH di http://rsb.info.nih.gov/ij/ ) ^2.
4. Sacrificare gli animali al giorno 3 dopo l'infezione per inalazione dei isoflurano seguita da dislocazione cervicale.
5. Osservare e registrare la lesione sulla pelle.
6. Nick la pelle con un paio di forbici sterili.
7. Sbucciare la pelle fuori e osservare attentamente e registrare la lesione del muscolo.
8. Accise della lesione e di circa 2 - 5 mm della zona circostante.
9. Raccogliere milza e reni.
10. Omogeneizzare i tessuti utilizzando un omogeneizzatore tessuto o dalla ripetuta applicazione di un pistone di una siringa da 1 ml in una provetta da microcentrifuga contenente il tessuto e 100 ml di DPBS.
11. Aggiungere 900 ml di DPBS ad ogni provetta.
12. Vortex i campioni per 5 minuti.
13. Serie diluire la sospensione con DPBS ¹⁰ gennaio-10 giugno.
14. Piastra le sospensioni diluito su piastre THA.

5. Rappresentante dei risultati:

1. Subito dopo ogni iniezione sottocutanea, una bozza verrà osservato sulla superficie della pelle quando l'infezione è fatto correttamente (Figura 1A). Se non bleb si osserva sulla superficie della pelle, l'iniezione può essere troppo profondo, e questo può influenzare l'esito dell'infezione (dimensione della lesione, CFU).
2. La sospensione batterica deve essere diluito in serie e la CFU devono essere esaminati su piastre di agar sangue per ogni esperimento. Questo passo porterà importanti informazioni: 1) se l'inoculo hanno fenotipo omogeneo; 2) l'esatto numero di organismi vitali per l'infezione batterica.
3. Le lesioni e la sopravvivenza dei batteri può essere valutato in vari momenti dopo l'infezione. Qui, abbiamo esaminato l'infezione al giorno 3 dopo l'infezione. Le dimensioni della lesione vengono analizzati sulla superficie della pelle (Figura 1B: 1x 10 ^9; 1D Figura: 1 x 10 ⁷ CFU) e sulla superficie del muscolo (Figura 1C: 1x 10 ⁹ ; Figura 1E: 1 x 10 ⁷ CFU). L'area di lesione uguale lunghezza (mm) x larghezza (mm) può essere misurato per valutare il danno tissutale (Fig. 2 A e B). Questo risultato può aiutare a determinare l'entità del danno tissutale causato da un fattore di virulenza dato. Inoltre, le lesioni sono escisse e omogeneizzati in DPBS, e placcato per quantificare il numero di CFU (Figura 2C), che indica la vitalità dei batteri nella sede di infezione.

Figura 1. La pelle e le lesioni muscolari. CD1 topi sono stati inoculati per via sottocutanea su un fianco con MRSA (LAC). Le foto sono state scattate a 0 ora e il giorno 3 post-infezione. (A) durante il giorno 0 post-infezione (pi), (B) - (G) 3 ° giorno pi, B, D e F: lesioni cutanee, C, E e G: lesioni muscolari, B e C: 1 x 10 ⁹ CFU infetti, D ed E: 1 x 10 ⁷ CFU infetti, F e G: finto.

Figura 2. Dimensioni della lesione cutanea e batteri vitali contare nella sede di infezione al giorno 3 dopo l'infezione. Lesioni della pelle e muscoli sulla MRSA (LAC) infettati topi CD1. (A) dimensioni lesione della pelle. (B), dimensione della lesione muscolare. (C) Totale CFU tessuto. H: 1 x 10 ⁹ inoculi CFU; L: 1 x 10 ⁷ CFU inoculi. *: P <0,05, test di Mann-Whitney.

1. La pelle morbida modello murino e l'infezione dei tessuti è un potente strumento per la valutazione di virulenza in vivo di un agente patogeno. La patogenicità di S. aureus in infezioni della pelle e dei tessuti molli può variare in funzione una serie di parametri. Queste includono la dimensione dell'inoculo, fase di crescita batterica, la profondità di inoculazione, all'età di topi, e lo sfondo del mouse genetico ^{7, 8.} Nell'esaminare la funzione di virulenza utilizzando questo modello, è fondamentale per il controllo di questi parametri per garantire che i risultati saranno coerenti. Abbiamo studiato l'infezione da MRSA della pelle in diversi ceppi di topi, tra cui SKH1 (topi nudi), C57BL / 6, BALB / c, e CD1. Esiti dell'infezione variano in ⁷ diversi ceppi, in linea con altri rapporti che il patrimonio genetico del topo è un importante determinante della gravità della infezione da MRSA ^1. In questo esperimento, utilizziamo topi CD1 perché questo ceppo di topi è stato dimostrato di essere adatto per gli studi di S. fattori di virulenza aureus ⁵ ed è meno costoso di altri ceppi.
2. Per garantire che i risultati degli esperimenti sono coerenti, la colonia scelto di infezione devono essere controllati per il suo fenotipo emolisi prima di ogni esperimento. Il β-emolitico di fenotipo su agar sangue di pecora (un alone attorno alla colonia) riflette l'espressione di α-tossina dal S. aureus isolare. Questo passo è fondamentale perché mutazione spontanea di un S. aureus regolatore globale è stato segnalato a verificarsi, con conseguente depressione α-tossina espressione ^6. S. aureus manca α-tossina espressione presenta un fenotipo meno virulento rispetto a ceppi isogeni che esprimono α-tossina ^4.
3. Dopo la rasatura dal retro di topi, applicare circa 5 mm ³ dimensioni crema Epilatore (acquisto dal negozio locale di droga) per l'area rasata. Questo passo non mancherà di tenere la schiena di topi privi di capelli per 5 a 7 giorni. Diversi tipi di creme per capelli rimozione funziona, tuttavia, è importante sceglierne uno che induce la minor quantità di irritazione cutanea. Si consiglia di creme Epilatore con olio per bambini.
4. Quando si inietta la sospensione batterica, una bozza verrà osservato sulla superficie della pelle (Figura 2A). Quando l'iniezione è troppo in profondità (non bleb osservato), la sospensione può essere inoculato nel muscolo, che possa influire sul risultato infezioni a causa del sito di infezione sbagliato, e lesione e il recupero CFU dai tessuti sottocutanei per quel topo sarà diverso.
5. Oltre alla dimensione della lesione e contare CFU, variabili dipendenti possono essere esaminati per valutare la virulenza. Questi includono diffusione dei batteri, i livelli sierici di citochine, infezioni del sito citochine e chemochine livelli, reclutamento PMN, istologia e ^{3, 6.}
6. Per istologia e analisi immunochimica, tessuto infetto può essere asportato e fissati in formalina al 10% durante la notte. Quando ablazione dei tessuti infetti, 2 - 5 millimetri di tessuto sano suonare la lesione deve essere tagliato con la lesione. Ciò assicurerà che non tessuti profondi patologiche sono omessi.

Questo lavoro è stato supportato da una Burroughs-Wellcome Premio alla Carriera e da National Institutes of Health a concedere AI074832 GY Liu.