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La via classica è attivata da anticorpi e culmina nella lisi delle cellule bersaglio. Il CH 50 fornisce una misura dell'attività complemento di un campione di siero. Questo video dimostra i passi coinvolti nella determinazione del CH 50 Di un campione di siero, i calcoli e l'interpretazione dei risultati.
Il sistema del complemento è un gruppo di proteine che, quando attivato portare a bersaglio la lisi cellulare e facilita la fagocitosi attraverso opsonisation. Componenti complementari individuali possono essere quantificati comunque questo non fornisce alcuna informazione circa l'attività della via. Il CH
Preparazione di 5x Veronal Buffered Saline (VBS)
Sensibilizzazione dei globuli rossi di pecora con emolisina
CH 50 test
Calcoli
Rappresentante dei risultati:
Il video contiene un esempio di risultati rappresentativi. In pratica, un siero di controllo viene eseguito anche allo stesso tempo come il siero in esame e viene trattato nella stessa maniera. Qui di seguito (Tabella 1) è un dato campione da un campione testato siero. I dati sono manipolati secondo l'equazione presentata in 5.3.
Campione | OD 540 | Dire | ||
Vuoto | 0,042, 0,044 | 0,043 | ||
Lisi totale | 0,183, 0,183 | 0,183 | ||
Diluizione | OD 540 | Dire | Significa-Blank | % Lysis |
01:08 | 0,200, 0,219 | 0,210 | 0,168 | 116 |
01:16 | 0,179, 0,173 | 0,176 | 0,134 | 93 |
01:32 | 0,134, 0,110 | 0,122 | 0,08 | 55 |
1:64 | 0,053, 0,066 | 0,059 | 0,017 | 12 |
1:128 | 0,044, 0,045 | 0,045 | 0,003 | 2 |
Figura 1. Attivazione della via classica del complemento. La via classica è attivata dal legame con immunoglobuline M (IgM) o immunoglobuline G (IgG) sulla superficie della cellula bersaglio. La porzione Fc della Ab lega al C1q, C1r è attivata e questo a sua volta attiva un'altra molecola di C1r che, insieme, attivare due molecole di C1s. C1s si unirà ora C4 che espone il sito di legame per la C2, che è anche spaccati. Il legame di C4b e C2a porta alla formazione di un complesso chiamato C3 convertasi. Questo complesso si unirà ora C3 formando C3a e C3b, alcune delle quali si combinano con la C3 convertasi formando una C5 convertasi. Questo complesso agisce ora in C5, con la conseguente C5b legame con C6 di avviare la formazione del complesso di attacco alla membrana (MAC). C5b6 agisce sul C7, che a loro volta agiscono su C8 e C9 in ultima analisi, causando la formazione della finale MAC. (Goldsby et al, 2003).
Figura 2. Rappresentazione grafica dei dati di esempio e il calcolo del CH50 per un controllo e campione di siero. (A), la percentuale calcolata (%) lisi sia del controllo (•) e test () campioni di siero sono tracciati contro il fattore di diluizione. (B) Per calcolare la lisi del 50%, viene disegnata una linea dal valore percentuale del 50% fino ad intersecare con le linee del grafico e poi una linea verticale viene disegnata fino alla diluizione. In questo esempio, è 35 volte diluizione del controllo e il 21,6 volte diluizione del siero in esame sono tenuti a raggiungere il 50% lisi. Questi dati indicano che c'è meno complemento presenti nel siero in esame rispetto al controllo, come ha richiesto meno di diluizione prima 50% lisi è stato raggiunto. Il campione di controllo mostra anche> 100% lisi alla diluizione 1:8. Questo è molto probabilmente dovuto alla lisi incompleta del SRBC dall'acqua distillata e più efficiente lisi dai componenti del complemento.
Il CH 50 saggio è soggetta a molte interferenze. Alcuni SRBC sono più fragili di altre, con conseguente emolisi spontanea che non è correlata a completare l'attività. L'affinità degli anticorpi di coniglio varia da lotto a lotto e da un costruttore all'altro, questo influisce sulla quantità di anticorpo che si lega alla GRP. Inoltre, il processo di sensibilizzazione SRBC con risultati anticorpi nelle cellule con quantità diverse di rivestimento degli anticorpi del GRP. Raccolta dei campioni e conservazione sono un'importante fonte potenziale di errore. Componenti del complemento ad esempio C1q, C3, C4 e C5 sono estremamente labili, trattamento dei campioni in modo corretto è un fattore critico. L'esposizione prolungata al calore si riduce l'attività complementare e produrrà frammenti inattivi di componenti del complemento. Per rilevare come molte fonti di errore possibile, è fondamentale per il test di un siero di controllo con una nota CH 50 un valore ogni volta che viene eseguito il test e per riprodurre il valore accettato del controllo siero. Un modo per determinare se ci sono differenze tra i diversi lotti di SRBC e emolisina è quello di testare nuovi materiali di prova contro un campione standard di siero più volte e quindi determinare se ci sono variazioni del livello basale di emolisi o nel valore 50 CH per il siero di controllo.
L'autore desidera ringraziare la signorina Lora Matthews per eseguire la tecnica e il signor Paolo Pastore per la cinematografia. Questo progetto è stato finanziato dalla University of South Australia, il programma di Medicina di Laboratorio.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Sheep red blood cells | CSL | 2490201 | Use at 1% final |
Serum | Human serum | ||
Rabbit Anti-Sheep Haemolytic serum (RBCs), Unconjugated | AbD Serotec | C12HSB | |
96 well flat bottom plate | Sarstedt Ltd | 83.1839 | |
Veronal buffered saline | Use at 1x final | ||
Waterbath | |||
Plate reader | |||
37°C room/incubator |
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