Analisi di espressione genica da comunità microbiche marine utilizzando Trascrittomica Ambientale

Vi presentiamo un metodo per la generazione di cDNA da mRNA ambientale. In generale, l'RNA totale viene prima raccolto dall'ambiente, è selettivamente rimosso rRNA, mRNA è selettivamente amplificato, e cDNA sintetizzato dalla piscina mRNA arricchito è sequenziato. Sequenze recuperato può essere annotati utilizzando le normali tecniche di bioinformatica per identificare i geni espressi.

Analogamente al metagenomica, trascrittomica ambientale (metatranscriptomics) recupera e sequenze mRNA ambientali da un assemblaggio microbica senza una preventiva conoscenza di ciò che i geni della comunità potrebbe essere espresso. Così fornisce la prospettiva più imparziale sul espressione comunitaria gene

Lavorare con l'RNA

Perché RNasi sono onnipresenti e mRNA degradare rapidamente, precauzioni standard per lavorare in un ambiente privo di ribonucleasi devono essere seguite e campioni devono essere trattati o conservati, il più presto possibile dopo la raccolta.

Parte 1: l'ambiente RNA Collection (progettato per raccogliere biomassa nella frazione dimensioni 0,2-3,0 micron)

Forniture necessarie:
Masterflex tubi
Pompa peristaltica
3 micron alto il volume della capsula filtro a pieghe
0,22 micron Supor o policarbonato 142 millimetri filtro
142 millimetri filtro torre (Geotech Ambiente Equipment)
10-20 L damigiana (diplomato)
Whirl Packs
Azoto liquido
RLT buffer (Qiagen)
Beta-mercaptoetanolo

Setup:
Guanti puliti dovrebbero essere indossati ogni volta che la gestione dei filtri o di toccare i componenti interni della linea di filtro. Pinze dovrebbero essere tenuti in pulito, tubi da 50 ml coniche, preferibilmente pieno di etanolo. Per evitare che importanti cambiamenti nel pool di trascrizione, il filtraggio e tenere volte campione trattamento più breve possibile.

Posizionare un'estremità del tubo in acqua alla profondità desiderata per il campionamento. Sul lato opposto, collegare l'elevato volume 3 micron filtro. Collegare i 3 micron filtro alla torre di 0,22 micron del filtro. Diretto il deflusso dal 0,22 micron in una damigiana graduata.

Procedimento:

1. Eseguire diversi litri di acqua attraverso il sistema (non 0,22 micron filtro) per sciacquare. Al termine, rimuovere il tubo dall'acqua, mentre la pompa è in funzione per eliminare l'acqua residua dalla linea.
2. Utilizzando pinze, inserire un filtro di 0,22 micron sulla torre filtro e chiudere.
3. Posizionare la fine della linea di nuovo in acqua e accendere la pompa. Spurgare l'aria da entrambi i filtri. Controllare il volume di acqua filtrata con la laurea in damigiana.
4. Quando il volume desiderato è stato filtrato, rimuovere la riga da eliminare l'acqua e l'acqua residua dal sistema.
5. Non appena il filtro è asciutto, rimuovere velocemente la piastra superiore del filtro e piegare il filtro. Posizionare il filtro in una confezione vortice o 15 ml di tubo di raccolta da 2 ml di tampone RLT con beta-mercaptoetanolo. Snap congelare in azoto liquido.

Parte 2: estrazione di RNA totale da 0,22 micron filtro

Questa parte utilizza la QIAGEN RNeasy kit mini con modifiche alle istruzioni del costruttore

1. Preparare tallone tubi battendo con l'aggiunta di 8 ml di tampone RLT (beta-mercaptoetanolo aggiunto) in una provetta da 50 ml. Aggiungere 1-2 ml di perline di RNA da un kit di estrazione MoBio Powersoil
2. Rimuovere rapidamente il filtro congelato dal congelatore e, tenendolo nella confezione vortice, si frantumano con un martello. In alternativa, tagliare i filtri a piccoli pezzi nel tubo di raccolta (15 ml) con una lama di rasoio sterile e aggiungere il tutto al tubo preparato (50ml).
3. Aggiungere il filtro in frantumi al tubo preparato (50ml), e sigillare il coperchio tubo con parafilm o nastro laboratorio.
4. Vortex per 10 minuti alla massima velocità utilizzando un vortex con un allegato di 50 mL.
5. Centrifugare il tubo da 50 ml a 5000 rpm per 1 min a temperatura ambiente.
6. Rimuovere il più possibile del lisato e trasferirlo in una provetta da 15 ml.
7. Centrifugare i 15 ml tubo per 5 min a 5000 x g.
8. Trasferire il surnatante (~ 7 ml) a un nuovo tubo da 50 ml.
9. Aggiungere 1 volume (~ 7 ml) di 100% EtOH al lisato.
10. Usando una siringa da 30 ml, che si inserisce nel tubo da 50 ml, disegnare il lisato attraverso un ago da 18-21 gauge e passare di nuovo fuori ~ 5 volte. Al termine, lasciare il lisato nella siringa.
11. Continua l'estrazione con il kit QIAGEN RNeasy Mini. È utile usare un collettore di aspirazione, in quanto il volume del lisato (~ 14 ml) è molto più alto rispetto al protocollo kit originale (0,7 ml). In alternativa, il lisato può essere tracciata attraverso con l'aggiunta di 700 microlitri alla colonna, centrifugazione, e ripetendo fino a quando tutto il lisato è stato applicato alla colonna.
12. Inserire una colonna rotazione sul collettore di aspirazione e applicare 700 ml di campione. Applicare pressione di vuoto al collettore di prelevare il lisato. Continuare ad aggiungere il lisato dalla siringa fino a quando tutto questo è stato applicato alla colonna.
13. Aggiungere 700 microlitri di buffer RW1 alla colonna e disegnare giù con la pressione di vuoto.
14. Aggiungere 500 microlitri di buffer RPE alla colonna e disegnare giù con la pressione di vuoto.
15. Aggiungere una seconda aliquota di 500 microlitri di buffer RPE alla colonna e disegnare giù con la pressione di vuoto.
16. Una volta che il lavaggio è stato interamente disegnato attraverso, rimuovere la colonna e mettere in un tubo di raccolta.
17. Centrifugare la provetta per 1 minuto a 8000 x g. Gettare flow-through.
18. Centrifugare un ulteriore 2 min a 8000 xg per sbarazzarsi del EtOH.
19. Trasferimento in una nuova colonna 2 ml colcolta tubo. Pipettare 35 ml di acqua RNase-free direttamente sulla membrana. Chiudere tubo e lasciare riposare per 1 minuto.
20. Centrifugare per 2 min a 8000 x g.
21. Quantificare l'RNA totale spettrofotometricamente.

Parte 3. DNAsi trattamento

Questa parte utilizza il DNA-free TURBO Ambion kit in base alle istruzioni del costruttore

1. Aggiungere 3,4 microlitri 10x DNasi I buffer e 1ml io rDNase al campione di RNA.
2. Incubare a 37 ° C per 30 min.
3. Vortex il Reagente inattivazione della DNasi e aggiungere 3,4 ml di reagente inattivazione al campione.
4. Incubare 2 minuti a temperatura ambiente con miscelazione occasionali.
5. Spin a 10.000 xg per 1,5 minuti a temperatura ambiente, quindi trasferire il surnatante in una nuova provetta. Evitare di introdurre il reagente inattivazione nel tubo fresca.

Parte 4. In primo luogo la rimozione rRNA

Questa parte utilizza il kit Epicentre mRNA-solo in base alle istruzioni del costruttore

1. Mescolare delicatamente e centrifugare brevemente l'mRNA-unica reazione 10X Buffer prima dell'uso.
2. In una sterile (RNasi-free) 0,5 ml di tubo, combinare i componenti della reazione seguente sul ghiaccio:

   mRNA-SOLO tampone di reazione 10X	2,0 microlitri
   RNasi inibitore	0,5 microlitri
   RNA totale del campione (200 ng-10 mg)	Microlitri 16,5
   Terminator esonucleasi (1 unità)	1,0 microlitri
   Volume totale	20,0 microlitri

3. Incubare la reazione a 30 ° C per 60 minuti in un termociclatore (con coperchio riscaldato) o bagnomaria.
4. Terminare la reazione con precipitazioni Fenolo / EtOH:
   1. Aggiungi RNasi-free H2O per un volume totale di 200 l (= 180 mL).
   2. Estratto: Fenolo: Cloroformio (1:1), 1 volume (= 200 mL). Energicamente e poi girare 2-5 minuti alla massima velocità.
   3. Rimuovere fase acquosa (~ 200 l).
   4. Aggiungere 0,1 volumi di acetato di sodio 3 M (20 l) + 2,5 di volume del 100% ghiacciata EtOH (500 microlitri)
   5. Incubare a -80 ° C per 15-30 minuti.
   6. Pellet a 4 ° C, velocità massima, 30 min, notare la posizione del tubo per l'aspirazione più tardi di campione (pellet può essere difficile da vedere).
   7. Gettare il surnatante con aspiratore o pipetta.
   8. Lavare con 500 microlitri ghiaccio EtOH 70% freddo. Risospendere vortexando.
   9. Centrifugare per 10 minuti alla massima velocità. Gettare il surnatante.
   10. Centrifugare il liquido restante con tubo di nuovo 10 minuti alla massima velocità.
   11. Aspirare il liquido e asciugare con cura pellet completamente lasciandolo aperto per circa 10 minuti sotto il cofano.
   12. Risospendere in 15-20 microlitri RNasi-free H2O (volume massimo di MICROBExpress ingresso è di 15 microlitri), lasciate riposare per 5 minuti a temperatura ambiente.
   13. Usa Bioanalyzer o Experion per verificare la contaminazione da rRNA e la qualità di mRNA in questa fase.
   14. Questo è un potenziale punto di sosta. RNA possono essere conservati a -80 ° C di stoccaggio.

Parte 5. Secondo rRNA rimozione

Questa parte utilizza la Ambion MICROBEnrich e kit MICROBExpress secondo le istruzioni del produttore. Entrambi i kit può essere utilizzato più volte per aumentare l'efficienza del eucarioti (MICROBEnrich) e procariotiche (MICROBExpress) rimozione rRNA. L'ingresso di RNA totale dovrebbe essere tra 20-10 mg. Il volume di RNA deve essere inferiore a 15 microlitri. Così, l'ingresso ideale è> 150 ng / mL. -

MICROBEnrich

1. Pipettare 300 microlitri di buffer Binding in una provetta 1,5 ml
2. Aggiungere 500-100 mg di RNA totale in un volume massimo di 30μl e vortice delicatamente
3. Aggiungere 2 ml di Mix Capture Oligo per 5 mg di RNA nel buffer Binding. Toccare tubo delicatamente e centrifugare brevemente la miscela.
4. Miscela denaturare a 70 ° C per 10 min
5. Temprare la miscela a 37 ° C per 1 ora. Preparare le perline in questo incubazione.
6. Preparare Oligo MagBeads (di solito 25 microlitri) con il lavaggio una volta in acqua priva di nucleasi e una volta nel buffer di rilegatura, catturando le perle su un supporto magnetico tra i lavaggi. Conservare le perline sul ghiaccio. Riscaldarli fino a temperatura ambiente 5 minuti prima dell'uso.
7. Riscaldare la soluzione di lavaggio a 37 ° C in blocco termico.
8. Aggiungere il RNA / capture Mix Oligo al MagBeads lavato Oligo. Mescolare molto delicatamente il tubo e girare brevemente.
9. Incubare la miscela a 37 ° C per 15 minuti.
10. Posizionare il tubo nel supporto magnetico e attendere ~ 3 min.
11. Aspirare il surnatante (contenente mRNA) e trasferimento in un tubo di raccolta sul ghiaccio.
12. Aggiungere 100 ml di pre-riscaldato soluzione di lavaggio a microsfere catturato. Delicatamente vortice le perline brevemente.
13. Cattura perline e recuperare il surnatante. Piscina questo surnatante con mRNA nel tubo di raccolta sul ghiaccio (~ 450 microlitri di volume finale).
14. Posizionare il tubo di raccolta sul ghiaccio. Se un secondo turno sta per essere eseguita, tornare alla 5.3) sezione e ripetere la procedura. In alternativa, passare subito al kit MICROBExpress (5,18, vedi sotto).
15. OlioBeads utilizzato può essere utilizzato una seconda volta. Rigenerare il Oligobeads incubando con 2 volumi (di solito 50 ml) di soluzione di rigenerazione 1 per 1 ora. Catturare le perle in uno stand magnetico. Lavare due volte con 2 volumi di soluzione Rigenerazione 2 (di solito 50 ml) e risospendere nel loro volume originario di soluzione Resuspension (di solito 25 mL).
    MICROBExpress
16. Pipettare 200 microlitri di buffer Binding in una provetta 1,5 ml.
17. Aggiungi 2-10 mg di RNA totale in un volume massimo di 15μl e vortice delicatamente.
18. Aggiungere 4 ml di Mix Capture Oligo per l'RNA nel buffer Binding. Toccare tubo delicatamente e centrifugare brevemente la miscela.
19. Miscela denaturare a 70 ° C per 10 min.
20. Temprare miscela a 37 ° C per 15 minuti Preparare perline durante questa incubazione.
21. Preparare MagBeads Oligo con il lavaggio una volta in acqua priva di nucleasi seguito da due lavaggi in 50 microlitri di buffer Binding, catturando le perle su un supporto magnetico tra i lavaggi. Perline Risospendere in 50 microlitri di buffer Binding e incubare a 37 ° C fino al momento dell'uso.
22. Riscaldare la soluzione di lavaggio a 37 ° C in blocco termico
23. Vortex lavato Oligo MagBeads delicatamente. Aggiungere 50 microlitri MagBeads Oligo di RNA / capture Mix Oligo. Mescolare molto delicatamente il tubo e girare brevemente.
24. Incubare miscela a 37 ° C per 15 minuti.
25. Posizionare il tubo nel supporto magnetico e attendere ~ 3 min.
26. Aspirare il surnatante (contenente mRNA) e trasferimento in un tubo di raccolta sul ghiaccio.
27. Aggiungere 100 ml di pre-riscaldato soluzione di lavaggio a microsfere catturato. Delicatamente vortice le perline brevemente.
28. Cattura perline e recuperare il surnatante. Piscina questo surnatante con mRNA nel tubo di raccolta sul ghiaccio (~ 350 microlitri di volume finale).
29. Se un secondo turno sta per essere eseguita, tornare alla sezione 5.18) e ripetere la procedura. In alternativa, procedere immediatamente a mRNA precipitazioni.
30. Precipitare e mRNA risospendere:
    1. Per aggiungere il pool di mRNA 35 microlitri di sodio acetato e aggiungere 7 glicogeno microlitri.
    2. Aggiungi 1175 microlitri EtOH freddo ghiaccio al 100% e vortice accuratamente.
    3. Precipitato a -20 ° C per almeno 1 ora.
    4. Centrifugare per 30 min a 10.000 x g.
    5. Con attenzione decantare e scartare il surnatante.
    6. Aggiungere 750 microlitri EtOH freddo ghiaccio il 70% e mescolare brevemente nel vortex.
    7. Centrifugare per 5 minuti a 10.000 xg surnatante e gettarlo.
    8. Fare un secondo lavaggio del 70% EtOH.
    9. Brevemente respin il tubo dopo aver scartato il secondo lavare il 70% EtOH.
    10. Rimuovere con cautela il surnatante con una pipetta.
    11. Far asciugare i pellet per 5 min.
    12. Risospendere il pellet di RNA in 25 microlitri TE buffer o RNasi acqua libera
    13. Reidratare RNA per 15 minuti a temperatura ambiente.
    14. Vortex il campione con forza, se necessario.
31. Se è necessario rimuovere i rimanenti perline, tubo posto in stand magnetici per ~ 3 minuti e passare mRNA arricchito al nuovo tubo RNasi libero.
32. Usa Bioanalyzer o Experion per verificare la contaminazione da rRNA e la qualità di mRNA in questa fase.
33. Questo è un potenziale punto di sosta. RNA possono essere conservati a -80 ° C di stoccaggio.

Parte 6: Amplificazione mRNA

Questa parte utilizza la Ambion MessageAmp II-I batteri kit in base alle istruzioni del produttore. Calcolare Master Mix online www.ambion.com/tools/ma2bact .

1. Poliadenilazione di RNA modello:
   1. Posto fino a 1000 ng di RNA totale (di solito 100-500 ng) o fino a 500 ng di mRNA (tipicamente 10 ng-200 ng) in una sterile RNasi-free provetta per microcentrifuga. L'uso 6,5 ml di campione e senza acqua RNasi libero nel buffer prima.
   2. Incubare 10 minuti a 70 ° C, preferibilmente in un termociclatore.
   3. Rimuovere i campioni di RNA dal 70 ° C incubatore e centrifugare brevemente (~ 5 s) per la raccolta del campione sul fondo della provetta. Mettere il composto in ghiaccio per 3 min.
   4. Preparare Master Mix poliadenilazione in una nucleasi-free tubo a temperatura ambiente nell'ordine indicato sul foglio di calcolo. Montare mix abbastanza master per tutti i campioni della sperimentazione, tra cui eccedenza ≤ 5% per coprire errori di pipettamento. Delicatamente vortice di fare una miscela omogenea, senza inattivazione dell'enzima, quindi si centrifuga per ~ 5 s per raccogliere le master mix alla base del tubo.
   5. Trasferire 3,5 ml di poliadenilazione Mix Master ogni campione di RNA, mescolare accuratamente vortexando dolce e seguire con un giro veloce per raccogliere la reazione.
   6. Posizionare i campioni a 37 ° C incubatore. Reazioni incubare per 15 minutia 37 ° C, quindi centrifugare brevemente per raccogliere la reazione nella parte inferiore del tubo.
   7. Dopo l'incubazione a 37 ° C, luogo le reazioni sul ghiaccio e procedere immediatamente alla trascrizione inversa.
2. Trascrizione inversa per sintetizzare Strand Prima cDNA:
   1. Preparare Reverse Master Mix Trascrizione in una nucleasi-free tubo a temperatura ambiente nell'ordine indicato sul foglio di calcolo. Montare mix abbastanza master per tutti i campioni della sperimentazione, tra cui eccedenza ≤ 5% per coprire errori di pipettamento. Delicatamente vortice di fare una miscela omogenea, senza inattivazione dell'enzima, quindi si centrifuga per ~ 5 s per raccogliere le master mix alla base del tubo.
   2. Trasferire 10 ml di mix master inversa trascrizione a ciascun campione, mescolare accuratamente vortexando gentilmente, e seguire con un giro veloce per raccogliere la reazione.
   3. Mettere i campioni in un 42 ° C incubatore. Incubare per 2 ore a 42 ° C, quindi centrifugare brevemente (~ 5 s) per raccogliere la reazione nella parte inferiore del tubo.
   4. Collocare le provette su ghiaccio e procedere immediatamente alla sintesi del secondo filamento cDNA.
3. Strand Synthesis secondo cDNA:
   1. Sul ghiaccio, preparare un secondo Master Mix Strand mescolando i seguenti reagenti nell'ordine indicato nel foglio di calcolo. Montare mix abbastanza master per tutti i campioni della sperimentazione, tra cui eccedenza ≤ 5% per coprire errori di pipettamento. Delicatamente vortice di fare una miscela omogenea, senza inattivando gli enzimi, quindi si centrifuga per ~ 5 s per raccogliere le master mix alla base del tubo.
   2. Trasferire 80 ml di Mix Seconda Maestro Strand a ciascun campione, mescolare accuratamente vortexando gentilmente, e seguire con un giro veloce per raccogliere la reazione.
   3. Mettere i campioni in una ° 16 C cycler termico. E 'importante per raffreddare il blocco termociclatore a 16 ° C prima di aggiungere le provette di reazione perché sottoponendo le reazioni a temperature> 16 ° C compromesso resa ARNA.
   4. Incubare 2 ore a 16 ° C Incubare 2 ore in una ° 16 C cycler termico. Se la temperatura coperchio non può essere regolato per adattarsi alla temperatura del blocco ° 16 C, le reazioni coprire con il coperchio riscaldato spento, o se il coperchio non può essere spento, non coprono i tubi con esso.
   5. Luogo reazioni brevemente ghiaccio. Non lasciare le reazioni in ghiaccio per lunghi periodi di tempo.
4. 5.4) Purificazione del DNA:
   1. Tutte le centrifugazioni in questa procedura di purificazione dovrebbe essere fatto a 10.000 xg (tipicamente ~ 10.000 giri al minuto) a temperatura ambiente. Controllare il Buffer cDNA Binding per la precipitazione prima di utilizzarlo. Se il precipitato è visibile, scioglierla dal riscaldamento la soluzione a 37 ° C per un massimo di 10 minuti e vortex vigorosamente. Raffreddare a temperatura ambiente prima dell'uso.
   2. Prima di iniziare la purificazione cDNA, preriscaldare il flacone da 10 ml di acqua priva di nucleasi a 50 ° C per almeno 10 min.
   3. Aggiungere 250 ml di cDNA Binding Buffer a ciascun campione e mescolare accuratamente delicatamente su vortex.
   4. Centrifugare per ~ 1 min a 10.000 g, o fino a quando la miscela è attraverso il filtro. Gettare il flow-through e sostituire la cartuccia del filtro cDNA nel tubo di lavaggio.
   5. Applicare 500 microlitri tampone di lavaggio in ogni cartuccia cDNA filtro. Centrifugare per ~ 1 min a 10.000 g, o fino a quando tutti il ​​tampone di lavaggio è attraverso il filtro. Gettare il flow-through e gira la cartuccia del filtro cDNA per un altro minuto per eliminare tracce di EtOH.
   6. Trasferimento cDNA cartuccia filtro a un tubo di eluizione del DNA. CDNA eluire con 20 ml di 50 ° C acqua priva di nucleasi. E 'importante utilizzare acqua priva di nucleasi che è a 50 ° C per l'eluizione del DNA. Acqua più freddo sarà meno efficiente a eluizione di cDNA, e l'acqua calda (> 55 ° C) può provocare resa ARNA ridotto.
   7. Al centro del filtro nella cartuccia cDNA filtro, applicare 20 l di caldo (50 ° C) Acqua priva di nucleasi. Lasciate a temperatura ambiente per 2 minuti e poi centrifugare per ~ 1.5 min a 10.000 xg, o fino a quando tutte le priva di nucleasi acqua attraverso il filtro. La doppia elica del DNA sarà ora in eluire (~ 16 microlitri).
   8. Il cDNA purificato può essere conservato durante la notte a -80 ° C, a questo punto se lo si desidera.
5. Trascrizione in vitro di sintetizzare ARNA
   1. Si raccomanda di usare un fornetto a causa della loro temperatura uniforme, sia perché è estremamente importante che non forma condensa all'interno dei tubi. Si raccomanda vivamente di h 14 incubazione reazione IVT per massimizzare la resa ARNA. Per il massimo rendimento Arna, condurre l'IVT in un volume di 40 microlitri di reazione finale.
   2. A temperatura ambiente, assemblare un Master Mix IVT con l'aggiunta di reagenti nell'ordine indicato sul foglio di calcolo. Mescolate bene delicatamente vortex. Centrifugare brevemente (~ 5 s) al Colgliere il Master Mix IVT sul fondo del tubo e posto sul ghiaccio.
   3. Trasferimento IVT Master Mix per ogni campione seguendo le linee guida del foglio di calcolo, mescolare accuratamente vortexando gentilmente, centrifugare brevemente per raccogliere la reazione, e posto i tubi a 37 ° C incubatore.
   4. Incubare per 14 ore a 37 ° C.
   5. Dopo l'incubazione, aggiungere acqua priva di nucleasi a ciascun campione ARNA per portare il volume finale di 100 ul. Mescolare accuratamente vortexando gentilmente. Posizionare il ARNA diluito su ghiaccio se la fase di purificazione ARNA sarà fatto immediatamente. In alternativa, il ARNA possono essere conservati a -20 ° C.
6. ARNA Purificazione
7. Tutte le centrifugazioni in questa sezione dovrebbe essere fatto a 10.000 xg (tipicamente ~ 10.000 rpm).
8. Prima di iniziare la purificazione ARNA preriscaldare il flacone da 10 ml di acqua priva di nucleasi a 55 ° C per> 10 min.
9. Aggiungere 350 ml di Buffer ARNA Binding per ogni campione ARNA. Mescolare accuratamente vortexando gentilmente, e procedere alla fase successiva immediatamente.
10. Aggiungere 250 ml di EtOH ACS grado 100% per ogni campione Arna, e mescolare pipettando il composto su e giù per 3 volte. Non vortex per miscelare. Procedere immediatamente alla fase successiva non appena si sono mescolati i EtOH in ogni campione.
11. Inserire un ARNA filtro a cartuccia in un tubo di raccolta Arna, e pipetta ogni miscela campione sul centro del filtro nel filtro ARNA cartuccia.
12. Centrifugare per ~ 1 min a 10.000 x g. Continuare fino a quando il composto è passata attraverso il filtro. Gettare il flow-through e sostituire la cartuccia del filtro ARNA in Provetta ARNA.
13. Applicare 650 microlitri tampone di lavaggio in ogni ARNA filtro a cartuccia. Centrifugare per ~ 1 min a 10.000 xg, o fino a quando tutta la soluzione di lavaggio è attraverso il filtro. Gettare il flow-through e gira la ARNA filtro a cartuccia per un ulteriore ~ ​​1 min per eliminare tracce di EtOH.
14. Trasferimento del filtro a cartuccia (s) per un nuovo tubo di raccolta ARNA. Al centro del filtro, aggiungere 75 microlitri di acqua priva di nucleasi che viene preriscaldato a 50-60 ° C. Sostituire il contenitore di acqua priva di nucleasi nel 50-60 ° C incubatore.
15. Lasciate a temperatura ambiente per 2 minuti e poi centrifugare per ~ 1.5 min a 10.000 xg, o fino a quando la soluzione è attraverso il filtro.
16. Ripetere l'eluizione con un secondo 75 ml di acqua priva di nucleasi. L'ARNA sarà ora in Provetta ARNA a circa 150 ml di acqua priva di nucleasi. Eliminare il ARNA filtro a cartuccia.
17. Conservare ARNA a -80 ° C e minimizzare i ripetuti di congelamento-scongelamento.

Parte 7: sintesi di cDNA

Questa parte utilizza la Promega Universale RiboClone cDNA kit sistema di sintesi, con leggera modifica alle istruzioni del produttore. Standard di ingresso 2 mg, per 454 sequenziamento, si consiglia di iniziare con 10 mg. Se la concentrazione è troppo bassa, il ARNA può essere concentrata sia con precipitazioni EtOH o concentrazione sottovuoto. Se 10 mg è usato come input RNA poi scala tutti i reagenti di un fattore di enzimi 5Il sono disponibili in diverse unità di ciascun lotto, in tal modo i volumi devono essere calcolati ogni volta.

1. Strand prima sintesi:
   1. Prendete un tubo da 0,5 ml PCR e aggiungere:

      mRNA campione	2 mg (o 10 mg se utilizzato per 454 sequenziamento)
      Hex Primer casuale (0,5 mg / ml)	2 microlitri
      Nucleasi acqua libera al volume	0 (o non è campione è stato diluito)
      Volume totale	15 microlitri

   2. Calore della reazione a 70 ° C per 10 min. Freddo provetta in ghiaccio per 5 minuti e girare leggermente per raccogliere la soluzione sul fondo del tubo.
   3. Aggiungere i seguenti componenti nell'ordine indicato:

      Campione	15 microlitri
      Strand Buffer primo 5X	5 microlitri
      RNasin ribonucleasi Inibitore 40 U	Microlitri 1 ... 40 U / mL
      Volume totale	21 microlitri

   4. Mix reaction e brevemente spin. Miscela di calore a 37 ° C per 5 min.
   5. Aggiungere i seguenti componenti:

      Campione dal punto 1	21,0 microlitri
      Pirofosfato di sodio, 40 mM	2,5 microlitri
      AMV Reverse Trancriptase 30 U	Microlitri 1,5 ... 22 U / mL
      Acqua priva di nucleasi	0,0 microlitri
      Volume totale	25,0 microlitri

   6. Incubare reazione per 1 ora a 37 ° C in fornetto.
   7. Dopo la reazione luogo di incubazione su ghiaccio.
2. Secondo Strand Synthesis:
   1. Aggiungere i seguenti componenti:

      First-Strand reazione	25,0 microlitri
      Secondo Strand Buffer 2.5X	40,0 microlitri
      BSA, 1 mg / ml	5,0 microlitri
      DNA polimerasi I 23 u	3,0 microlitri
      RNasi H 0,8 u	Microlitri 0,5 ... 1,5 U / mL
      Acqua priva di nucleasi	Microlitri 26,5
      Volume totale	100,0 microlitri

   2. Mescolare delicatamente muovendo il tubo. Incubare le reazioni a 14 ° C per 2 ore in un termociclatore. E 'importante per raffreddare il termociclatore a 14 ° C prima di aggiungere i tubi di reazione. Non lasciate che la reazione di ottenere superiore a 14 ° C prima o durante la reazione.
   3. Per terminare la reazione, aggiungere 2 unità di DNA polimerasi T4 per mRNA mcg di ingresso alla reazione. Incubare per 10 minuti a 14 ° C.
   4. Bloccare la reazione aggiungendo 10 ml di 500 mM DEPC trattati con EDTA e posto sul ghiaccio.
   5. Pulire il cDNA utilizzando una precipitazione EtOH o il Promega Wizard DNA-pulitura del sistema secondo le istruzioni del produttore. Conservare i campioni a -80 ° C. A doppia elica del DNA può essere direttamente pyrosequenced a questo punto.

L'indagine di espressione genica da parte delle comunità microbiche naturali è diventato comune negli ultimi anni come un mezzo per esplorare il ruolo ecologico e le funzioni dei microrganismi. Usato in combinazione con l'individuazione, quantificazione e caratterizzazione di microrganismi marini, analisi di espressione genica può essere usata per collegare filogenesi di funzionare in comunità microbiche naturali. Molte tecniche per il targeting espressione funzionale del gene contare su sonde specifiche o imposta Primer progettato per i geni di sequenza nota. Al contrario, trascrittomica ambientale può essere utilizzato per esaminare l'espressione genica senza vincoli imposti dai dati di sequenza esistenti e con preferenza per quei geni sono attivamente espressi. Analisi della piscina mRNA nell'ambiente può quindi fornire uno dei modi più efficaci per scoprire le connessioni tra le attività principali e gli organismi che li mediano.

L'applicazione iniziale di trascrittomica ambientale fornito una delle viste prima della composizione e le dinamiche della piscina mRNA batterico in un ³ ecosistema naturale. L'analisi dei geni espressi nelle biblioteche trascrizione sia da un costiera sale palude (Sapelo Island, GA) e un alcalino, hypersaline lago (Mono Lake CA) ha rivelato sequenze geniche di interesse biogeochimici, incluse le varianti ambientali di diversi geni funzionali come chitinasi e zolfo ossidazione dei geni che erano specifiche per ciascuno di questi ecosistemi. Ha anche fornito le prove per il romanzo, i processi inattesi, come la degradazione microbica di piante vascolari poliammine e delle alghe derivati ​​come carbonio possibile e fonti di azoto.

Come si evolvono le tecniche molecolari per ridurre le limitazioni associate a lavorare con l'RNA da campioni ambientali e migliorare le tecnologie di sequenziamento, trascrittomica ambientale è diventata una tecnica più largamente usato. E 'stato utilizzato per esaminare le funzioni dei microrganismi sulla superficie dell'oceano ⁶ e confrontare il giorno e l'espressione genica funzionale notte all'interno dello stesso ambiente ^7. Trascrittomica ambientale può essere utilizzato anche per ottenere una migliore comprensione delle risposte microbica a specifici fattori ambientali e biogeochimica. I geni o funzioni scoperti con questa tecnica può servire come obiettivi per studi più quantitativa di espressione genica come microarray e la PCR quantitativa.

Il finanziamento è stato fornito dalla Gordon and Betty Moore sovvenzioni della Fondazione e la National Science Foundation concedere MCB-0702125.