NZ רוצה להודות מעבדה חברי שובהאש ביזוואז, אנדרו Sproul, וראיין Willet לאימונים שלה לנתח והקציר נוירונים אוהד. נתמכות על ידי תרומות של NIH-NINDS.

1. הכנה לניתוח: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר את המנה המתאימה תרבות (10 ס&quot;מ או 6 צלחות, או גם 24 טוב, וכו &#39;) בהתאם לאופי הניסויים שלך, מעיל אותם עם זנב עכברוש 24 שעות לפני קולגן לנתיחה. שיטות להכנת עכברוש זנב קולגן ושימוש בו כדי המנות תרבות מעיל תוארו במקום אחר (1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון טריפסין 0.25% ב שנאגרו מלוחים פוספט (PBS) (ללא EDTA) ולסנן לעקר. הכן 1 aliquots מ&quot;ל ולאחסן ב -20 º C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן תמיסה המכילה 2.5 מ&quot;מ כל אחד uridine ו-5-FDU ב מזוקקים / deionized H 2 O. מסנן לעקר ולהכין 50 aliquots μl. חנות ב -20 º C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן בינוני השלם: RPMI 1640 בינוני התרבות עם חום מומת 10% נסיוב סוס (חום להשבית ידי דוגרים על 56 º C waterbath במשך 30 דקות) ו -5% בסרום שור העובר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן בינוני סופי: RPMI 1640 בינוני התרבות עם חום מומת 1% סוס סרום + NGF (ריכוז 100ηg/ml הסופי) + פניצילין / סטרפטומיצין (1 / 250) + 1 / 250 פתרון uridine/5-FDU (10 מיקרומטר הריכוז הסופי) . הערה: זה צריך להיות בינוני מורכב טרי לפני השימוש בכל פעם. לצורך ניסוי בתבנית של 24 גם צלחת, אחד יצטרך להכין 12 מ&quot;ל של מדיום זה. מומלץ לכם להכין תוספת קטנה. NGF ניתן לרכוש ממגוון רחב של מקורות מסחריים (ראו טבלה בסוף פרוטוקול זה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ציוד: אחד יהיה צורך במיקרוסקופ הניתוח, מקור האור. מתכווננת כפול סיבים אופטיים עם הפנס טיפים התמקדות היא העדיפה. בנוסף, יהיה צורך לנקות לעקר (מעוקר או על ידי השריית באתנול 70% לפחות 20 דקות) כלי החיתוך הבא: שני זוגות של מיקרו לנתח מלקחיים נירוסטה, וזוג מספריים לנתח (גם נירוסטה ושניהם מ Roboz). שני מחטי מזרק סטרילי (26 gague x ½ 1 ס&quot;מ או דומה) יהיה גם צורך. יש צורך להגדיר לוח לנתיחה, המהווה 3 חתיכה &quot;x3&quot; של קלקר עטוף בנייר אלומיניום מכוסה Kimwipe. רסס את הלוח עם אתנול 70% כדי לטהר. לבסוף, להכין אש מלוטש פיפטה מרעה זכוכית. כדי אש פולנית, לקחת את פיפטה זכוכית והחזק את הטיפ הלהבה למשך כמה שניות, בעוד סיבוב. לאחר בדיקה, טיפ תיראה חלקה פתיחת יהיה צר יותר. זה הכרחי עבור השלב שבו התאים יהיה מנותק. בצע אש ליטוש ברדס תרבית תאים כך פיפטה נשאר סטרילי. </li></ol> 2. Dissection של הגרעינים צוואר הרחם מעולה: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איסוף גורים עכברוש בילוד כי הם בגיל P0 או P1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במהירות לנגב את הגור לנתיחה עם אתנול 70% כדי להפחית את הסיכויים לזיהום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במהירות לערוף את הגור עם זוג מספריים חדות (שלב זה לא יהיה המוצג בסרטון). החזק את הראש באמצעות מלקחיים סטריליות נגד גזה סטרילית בקצרה לנקז דם עודף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הראש על כרית דיסקציה עם הצד הגחוני פונה כלפי מעלה, ואת הקצה הזנב מכוונת כלפיך. קנה הנשימה הקטועה צריך להיות גלוי לעין. השתמש במחטים מזרק סטרילי כדי לאבטח את ראשו הכרות לרפד את הניתוחים באופן הבא: לדחוף אחד את הסיכה כי הגג של הפה לתוך כרית ולדחוף את מספר הזיהוי האישי השני כי קנה הנשימה החתוך לתוך כרית. הנח את כרית מתחת למיקרוסקופ לנתח ולהתחיל לנתיחה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש בשני מלקחיים (אחד בכל יד) העור לסלק שומן סביב קנה הנשימה, טיפול לא להיכנס עמוק מדי. פעולה זו תחשוף זוג שרירים פועל כמעט במקביל זה לזה משני צדי קנה הנשימה. הערה: במהלך דיסקציה, תצטרך להשקות עם PBS סטרילי קר או קר, סרום חינם בינוני 1640 RPMI נמסר עם סטרילית, פיפטה פסטר לשטוף דם עודף כדי לשמור על האזור נקי ולח. ניתן לעשות זאת רק פעם או יותר מפעם אחת, תלוי כמה מהר מהם עובד. עבור מבתר חוויה, זה לוקח רק כ 2-3 דקות לנתח את זוג הגרעינים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש מלקחיים לחתוך ולהסיר את השרירים בצד אחד הראשונים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר שריר מוסר, העורק הראשי יהיה גלוי. לעתים קרובות הוא ורדרד בהיר והוא מכיל דם. זה אולי יראה בהיר יותר מאשר כלי דם אחרים אתה עשוי לראות בסביבה ומסיבה זו העורק הראשי לא יכול להיות מורגש מיד. עורק זה פועל לצד קנה הנשימה ואת bifurcates לתוך מה שנראה כמו &quot;Y&quot; בצורת סרט. הסתעפות זו היא ציון דרך חשוב ופעם הוא נמצא, זה יהיה קל יחסית למצוא את SCG. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סבר העורק בסוף הזנב ביותר להרים אותו מעט עם מלקחיים (את הקצה השני מחובר עדיין). ברגע שאתה עושה את זה, תוכל לראות שקדיות, מבריק מסה קטנה מחפש הרקמה מחוברת באופן רופף העורק רק בנקודת הסתעפות וכי יש thread דמוי מראש ו / או פוסט ganglionic connectives. זהו הגנגליון הצווארי מעולה. השתמש בזוג השני של מלקחיים ביד אחרים לנתק אותו בעדינות ומניחים בצלחת תרבות קטן (35 מ&quot;מ) המכיל קר, סרום חינם RPMI 1640 בינוני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר מכן, לחלץ את הגנגליון בצד השני של קנה הנשימה בעקבות פרוטוקול זהה. </li></ol> 3. ניקוי הגרעינים: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר כל הגרעינים כבר גזור החוצה, הם צריכים להיות משוחרר ככל האפשר של רקמה זרים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תחת המיקרוסקופ לנתיחה, אתה עשוי לראות כי בגרעיני יש המצורפת חתיכות של העורק הראשי, רקמת שומן או אחר. עבודה עם מלקחיים בכל יד לקנטר ממנו את החומרים האלה לא רצויות. המקום נוקה הגרעינים לתוך סטרילית 15ml חרוטי, צינור פוליפרופילן, המכיל RPMI 1640 בינוני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Connectives מראש ו / או פוסט ganglionic צריך להיות גם מטופח משם. הגנגליון לכל אחד יש כ -10,000 נוירונים. לאחר הנוירונים מצופה, הם יוכלו לצמוח מחדש neurites שלהם. </li></ol> 4. ביסוס תרבות Neuron הסימפתטית: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה הגרעינים ב 200xg למשך 2 דקות ו למחוק את supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend הגרעינים ב 0.5-1 מ&quot;ל של תמיסת טריפסין 0.25%. מקום 37 ˚ C waterbath או בחממה במשך 30 דקות. זה יעזור לנתק את התאים בגרעיני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 30 דקות, להוסיף 10 מ&quot;ל של מדיום השלם לדלל החוצה לנטרל את טריפסין ו צנטריפוגות ב 200xg במשך 2 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בטל supernatant ו resuspend ב 2 מ&quot;ל של מדיום הסופי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בהמשך לנתק את התאים על ידי triturating הגרעינים למעלה ולמטה עם אש מלוטש פיפטה זכוכית למרעה. Triturate הגרעינים 20 פעמים במקום צינור על קרח למשך כמה דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בינתיים, אש לצחצח את פיפטה יותר לעשות פתיחת צר (כ 2 / 3 עד 1 / 2 מ&quot;מ קוטר). חכה כמה דקות עד שהוא מתקרר triturate הגרעינים פי 20 יותר. כפי שאתה ממשיך, המדיום יהפוך בהדרגה מעורפל המציין כי התאים נמצאים ניתק. חזור על פעולה זו פעם או פעמיים יותר תלוי גם לנתק את התאים. לאחר זמן מה, תוכלו להבחין כי כל הגרעינים יש ניתק לתוך הנוירונים ולא הגרעינים שלמים נראים בצינור. אולי יש קצת חומר הרקמה לא לנתק. בשלב זה, לתת הצינור לשבת קרח למשך כמה דקות, כך כל פסולת undissociated ניתן ליישב לתחתית. עכשיו בזהירות לאסוף כמעט את כל המדיום מלמעלה ומניחים צינור אחר. על מנת להבטיח כי אתה לא לאסוף את השברים undissociated, להשאיר כ 50 μl בחלק התחתון של הצינור. הוסף יותר של המדיום הסופי צינור המכיל תאים ניתק: בכרך זה תלוי בסוג של צלחת אחת היא באמצעות תרבות לתרבות נוירונים. לדוגמה: אם מנה של 24 גם הוא להיות מועסק, אז 0.5 צלחת הגרעינים היטב לכל (~ 10,000 נוירונים מדי טוב) ב 0.5 מ&quot;ל של מדיום הסופי לכל טוב. המלטה עכברוש טיפוסית מורכבת 12 גורים, אשר ייתן 24 הגרעינים. זה מספיק כדי צלחת אחת 24 גם הזרע ואת הנפח הכולל של המדיום הסופי הוא 12 מ&quot;ל. הערה: הגרעינים מכילים גם אוכלוסייה קטנה של גליה סוגי תאים אחרים יהיו נוכחים בתרבות. Uridine/5-FDU שימוש במדיום הסופי שימנע את שגשוגם ולקדם את מותם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזנת התאים כל 48 שעות על ידי החלפת 2 / 3 של המדיום עם טרי RPMI 1% סוס סרום + NGF ו uridine/5-FDU. הערה: בשלב ראשון, התרבות מכיל נוירונים אוהד שנראים עגול עם neurites לא. Neurites קצר להיות גלוי 24 שעות לאחר דיסקציה בהדרגה להיות צפופים מסועפת יותר לאורך זמן. </li></ol>

<ol>
	<li>Banker, G., Goslin, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Culturing Nerve Cells. , (1998).</li><li>Biswas, S. C., Shi, Y., Sproul, A., Greene, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pro-apoptotic+Bim+Induction+in+Response+to+Nerve+Growth+Factor+Deprivation+Requires+Simultaneous+Activation+of+Three+Different+Death+Signaling+Pathways.">Pro-apoptotic Bim Induction in Response to Nerve Growth Factor Deprivation Requires Simultaneous Activation of Three Different Death Signaling Pathways.</a> The Journal of Biological Chemistry. 282 (40), 29368-29374 (2007).</li><li>Bocchini, V., Angeletti, P. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Nerve+Growth+Factor:+purification+as+a+30,000-molecular-weight+protein.">The Nerve Growth Factor: purification as a 30,000-molecular-weight protein.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. (64), 787-794 (1969).</li><li>Dechant, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chat+in+the+Trophic+Web:+NGF+Activates+Ret+by+Inter-RTK+Signaling.">Chat in the Trophic Web: NGF Activates Ret by Inter-RTK Signaling.</a> Neuron. 33 (2), 156-158 (2002).</li><li>Deckwerth, T., Elliott, J. L., Knudson, C. M., Johnson, E. M., Snider, W. D., Korsmeyer, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bax+is+required+for+neuronal+death+after+trophic+factor+deprivation+and+during+development.">Bax is required for neuronal death after trophic factor deprivation and during development.</a> Neuron. (17), 401-411 (1996).</li><li>Greene, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+in+Vitro+Studies+on+the+Nerve+Growth+Factor+(NGF)+Requirement+of+Neurons+-+I.+Sympathetic+Neurons.">Quantitative in Vitro Studies on the Nerve Growth Factor (NGF) Requirement of Neurons - I. Sympathetic Neurons.</a> Developmental Biology. (58), 96-105 (1977).</li><li>Park, D. S., Morris, E. J., Padmanabhan, J., Shelanski, M. L., Geller, H. M., Greene, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyclin-dependent+kinases+participate+in+death+of+neurons+evoked+by+DNA-damaging+agents.">Cyclin-dependent kinases participate in death of neurons evoked by DNA-damaging agents.</a> The Journal of Cell Biology. 143, 457-467 (1998).</li><li>Pierchala, B. A., Ahrens, R. C., Paden, A. J., Johnson, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nerve+Growth+Factor+Promotes+the+Survival+of+Sympathetic+Neurons+through+the+Cooperative+Function+of+the+Protein+Kinase+C+and+Phosphatidylinositol+3-Kinase+Pathways.">Nerve Growth Factor Promotes the Survival of Sympathetic Neurons through the Cooperative Function of the Protein Kinase C and Phosphatidylinositol 3-Kinase Pathways.</a> The Journal of Cell Biology. 279, 27986-27993 (2004).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

אנו משתמשים חולדות Sprague Dawley עבור התרבויות שלנו. קח את הזמן והטיפול כאשר מנקים את הגרעינים. הסר את כל פסולת, כלי דם ושומן. שלב זה חשוב בהבטחת תרבות פחות או יותר הומוגני חינם של סוגי תאים זרים. תוספת של uridine/5-FDU יהיה בעיקר לחסל את התאים הלא העצבית (mitotic) הנותרים לזהם את התרבות או לפחות לדכא את התרבות שלהם. בנוסף, במהלך השלב דיסוציאציה, להיות סבלנית ולקחת את הזמן כדי להפריד בין נוירונים כך שהם לא נמצאים גושים גדולים פעם הם זורעים לצלחות. לאחר גושים גדולים של תאים לא תניב תוצאות הניסוי טוב. לדוגמה, גושים גדולים יקשו את הנוירונים להיות transfected או נגועים. Immunostaining עשויים גם להתעכב וכל הניסויים הדורשים לספור את הנוירונים יהיה קשה לבצע, כמו גם. אין זה הכרחי כדי להשלים את המדיום עם עט / סטרפטוקוקוס בכל פעם התרבויות ניזונים. תוספת הזמן בעט / סטרפטוקוקוס הראשון התאים הם מצופה מספיק. האם להוסיף uridine/5-FDU טרי עד בינוני בכל פעם המדיום הוא החליף. השתמשנו תרבות העצבית הסימפתטית ללמוד אפופטוזיס בתגובה לנסיגה-NGF. לדוגמה, ביזוואז et al. 2007 (2), נוירונים אוהד היו transfected עם shRNA נגד מולקולות מספר תפקיד חשוב בקידום אפופטוזיס. Deckwerth et al. 1996 (5) השתמשו נוירונים אוהד מעכברים wildtype עכברים החסרים את הגן הפרו אפופטוטיים, באקס. הם בחנו כיצד הנוירונים האלה מתנהגים כאשר הם משוללי NGF. איור 6 מ ביזוואז et al. 2007 (2) ו איור 3 מ Deckwerth et al. 1996 (5) להראות מה transfected ולא transfected תרבויות העצבית הסימפתטית להיראות, בהתאמה.

<table><tbody><tr><td>Forceps, Stainless steel #5</td><td>Tool</td><td>Roboz Surgical Instruments Co.</td><td>RS4976</td><td></td></tr><tr><td>Scissors, DEAVER straight sharp-blunt- 43mm blades - 5.5</td><td>Tool</td><td>Roboz Surgical Instruments Co.</td><td>RS6760</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 w/ L-Glutamin</td><td>Reagent</td><td>Cellgro</td><td>10-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Reagent</td><td>SAFC Global</td><td>12103c</td><td></td></tr><tr><td>Donor Horse Serum</td><td>Reagent</td><td>JRH Biosciences</td><td>12449</td><td>Heat-inactivate by incubating in 56&amp;#x00B0;C waterbath for 30 minutes.</td></tr><tr><td>Penicillin/streptomycin</td><td>Reagent</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin without EDTA</td><td>Reagent</td><td>Difco Laboratories</td><td>MT 25-050-CI</td><td></td></tr><tr><td>Uridine</td><td>Reagent</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>U3003</td><td></td></tr><tr><td>5-Fluoro-5&amp;rsquo; deoxyuridine</td><td>Reagent</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F-8791</td><td></td></tr><tr><td>NGF</td><td>Reagent</td><td>Harlan Laboratories</td><td>BT-5025</td><td></td></tr><tr><td>Dissection Microscope and light source</td><td>Microscope</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>15 ml polypropylene tubes</td><td>Tool</td><td>BD Biosciences</td><td>352096</td><td></td></tr><tr><td>Cell culture dishes</td><td>Tool</td><td>Corning</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

protocol for culturing sympathetic neurons from rat superior cervical ganglia (scg)

הגרעינים צוואר הרחם מעולה (SCG) אצל חולדות הם קטנים, מבריק, דמוי שקד מבנים המכילים נוירונים אוהד. נוירונים אלה מספקים innervations אוהד לראש ואזורים הצוואר והם מהווים אוכלוסייה היטב מאופיין והומוגני יחסית (4). נוירונים הסימפתטית תלויים בגורם גדילה עצבי (NGF) לצמיחה, הישרדות בידול axonal והתפשטות רחבה הזמינות של NGF מקלה תרבותם מניפולציה ניסויית (2, 3, 6). מסיבות אלה, נוירונים בתרבית אוהד כבר בשימוש במגוון רחב של מחקרים כולל פיתוח בידול עצב, מנגנונים של מות תאים מתוכנת ופתולוגיים, ואת הולכת אותות (1, 2, 5, 6). לנתח את SCG מן החולדות יומו נוירונים culturing אוהד לא מאוד מסובך וניתן לשלוט די מהר. במאמר זה נתאר בפירוט כיצד לנתח את SCG מ גורים עכברוש היילוד להשתמש בהם כדי להקים תרבויות של נוירונים אוהד. המאמר כמו כן נתאר את הצעדים ההכנה ואת ריאגנטים שונים וציוד הנחוצים כדי להשיג זאת.

Watch this Scientific Journal Video about Protocol for Culturing Sympathetic Neurons from Rat Superior Cervical Ganglia SCG at JoVE.com

Protocol for Culturing Sympathetic Neurons from Rat Superior Cervical Ganglia SCG

זהו פרוטוקול המתאר כיצד לבודד תרבות נוירונים אוהד העיקרי של הגנגליונים צוואר הרחם מעולה (SCG) של גורי חולדה היילוד.

פרוטוקול נוירונים culturing הסימפתטית מן הגרעינים עכברוש צוואר הרחם מעולה (SCG)

The superior cervical ganglia (SCG) in rats are small, glossy, almond-shaped structures that contain sympathetic neurons.  These neurons provide ...

protocol-for-culturing-sympathetic-neurons-from-rat-superior-cervical

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

Protocol for Culturing Sympathetic Neurons from Rat Superior Cervical Ganglia (SCG)

22.8K Views.  Columbia University. זהו פרוטוקול המתאר כיצד לבודד תרבות נוירונים אוהד העיקרי של הגנגליונים צוואר הרחם מעולה (SCG) של גורי חולדה היילוד.

Video: Protocol for Culturing Sympathetic Neurons from Rat Superior Cervical Ganglia SCG

A Primary Neuron Culture System for the Study of Herpes Simplex Virus Latency and Reactivation

Herpes simplex virus type-1 (HSV-1) establishes a life-long latent infection in peripheral neurons. This latent reservoir is the source of recurrent reactivation events that ensure transmission and contribute to clinical disease. Current antivirals do not impact the latent reservoir and there are no vaccines. While the molecular details of lytic replication are well-characterized, mechanisms controlling latency in neurons remain elusive. Our present understanding of latency is derived from in vivo studies using small animal models, which have been indispensable for defining viral gene requirements and the role of immune responses. However, it is impossible to distinguish specific effects on the virus-neuron relationship from more general consequences of infection mediated by immune or non-neuronal support cells in live animals. In addition, animal experimentation is costly, time-consuming, and limited in terms of available options for manipulating host processes. To overcome these limitations, a neuron-only system is desperately needed that reproduces the in vivo characteristics of latency and reactivation but offers the benefits of tissue culture in terms of homogeneity and accessibility.
Here we present an in vitro model utilizing cultured primary sympathetic neurons from rat superior cervical ganglia (SCG) (Figure 1) to study HSV-1 latency and reactivation that fits most if not all of the desired criteria. After eliminating non-neuronal cells, near-homogeneous TrkA+ neuron cultures are infected with HSV-1 in the presence of acyclovir (ACV) to suppress lytic replication. Following ACV removal, non-productive HSV-1 infections that faithfully exhibit accepted hallmarks of latency are efficiently established. Notably, lytic mRNAs, proteins, and infectious virus become undetectable, even in the absence of selection, but latency-associated transcript (LAT) expression persists in neuronal nuclei. Viral genomes are maintained at an average copy number of 25 per neuron and can be induced to productively replicate by interfering with PI3-Kinase / Akt signaling or the simple withdrawal of nerve growth factor1. A recombinant HSV-1 encoding EGFP fused to the viral lytic protein Us11 provides a functional, real-time marker for replication resulting from reactivation that is readily quantified. In addition to chemical treatments, genetic methodologies such as RNA-interference or gene delivery via lentiviral vectors can be successfully applied to the system permitting mechanistic studies that are very difficult, if not impossible, in animals. In summary, the SCG-based HSV-1 latency / reactivation system provides a powerful, necessary tool to unravel the molecular mechanisms controlling HSV1 latency and reactivation in neurons, a long standing puzzle in virology whose solution may offer fresh insights into developing new therapies that target the latent herpesvirus reservoir.

The protocol describes an efficient and reproducible model system to study herpes simplex virus type 1 (HSV-1) latency and reactivation. The assay employs homogenous sympathetic neuron cultures and allows for the molecular dissection of virus-neuron interactions using a variety of tools including RNA interference and expression of recombinant proteins.

תא עצב ראשי מערכת התרבות לחקר וירוס הרפס סימפלקס המתנה ו הפעלה מחדש

Herpes simplex virus type-1 (HSV-1) establishes a life-long latent infection in peripheral neurons. This latent reservoir is the source of recurrent ...

Immunology and Infection

Bilaminar Co-culture of Primary Rat Cortical Neurons and Glia

This video will guide you through the process of culturing rat cortical neurons in the presence of a glial feeder layer, a system known as a bilaminar or co-culture model. This system is suitable for a variety of experimental needs requiring either a glass or plastic growth substrate and can also be used for culture of other types of neurons.
Rat cortical neurons obtained from the late embryonic stage (E17) are plated on glass coverslips or tissue culture dishes facing a feeder layer of glia grown on dishes or plastic coverslips (known as Thermanox), respectively. The choice between the two configurations depends on the specific experimental technique used, which may require, or not, that neurons are grown on glass (e.g. calcium imaging versus Western blot). The glial feeder layer, an astroglia-enriched secondary culture of mixed glia, is separately prepared from the cortices of newborn rat pups (P2-4) prior to the neuronal dissection.
A major advantage of this culture system as compared to a culture of neurons only is the support of neuronal growth, survival, and differentiation provided by trophic factors secreted from the glial feeder layer, which more accurately resembles the brain environment in vivo. Furthermore, the co-culture can be used to study neuronal-glial interactions1.
At the same time, glia contamination in the neuronal layer is prevented by different means (low density culture, addition of mitotic inhibitors, lack of serum and use of optimized culture medium) leading to a virtually pure neuronal layer, comparable to other established methods1-3. Neurons can be easily separated from the glial layer at any time during culture and used for different experimental applications ranging from electrophysiology4, cellular and molecular biology5-8, biochemistry5, imaging and microscopy4,6,7,9,10. The primary neurons extend axons and dendrites to form functional synapses11, a process which is not observed in neuronal cell lines, although some cell lines do extend processes.
A detailed protocol of culturing rat hippocampal neurons using this co-culture system has been described previously4,12,13. Here we detail a modified protocol suited for cortical neurons. As approximately 20x106 cells are recovered from each rat embryo, this method is particularly useful for experiments requiring large numbers of neurons (but not concerned about a highly homogenous neuronal population). The preparation of neurons and glia needs to be planned in a time-specific manner. We will provide the step-by-step protocol for culturing rat cortical neurons as well as culturing glial cells to support the neurons.

Here we provide a protocol for culturing rat cortical neurons in the presence of a glial feeder layer. The cultured neurons establish polarity and create synapses, and can be separated from the glia for use in various applications, such as electrophysiology, calcium imaging, cell survival assays, immunocytochemistry, and RNA/DNA/protein isolation.

Bilaminar משותף התרבות של נוירונים בקליפת המוח עכברוש ראשי גליה

This video will guide you through the process of culturing rat cortical neurons in the presence of a glial feeder layer, a system known as a bilaminar or ...

Neuroscience

Inducing Dendritic Growth in Cultured Sympathetic Neurons

The shape of the dendritic arbor determines the total synaptic input a neuron can receive 1-3, and influences the types and distribution of these inputs 4-6. Altered patterns of dendritic growth and plasticity are associated with impaired neurobehavioral function in experimental models 7, and are thought to contribute to clinical symptoms observed in both neurodevelopmental disorders 8-10 and neurodegenerative diseases 11-13. Such observations underscore the functional importance of precisely regulating dendritic morphology, and suggest that identifying mechanisms that control dendritic growth will not only advance understanding of how neuronal connectivity is regulated during normal development, but may also provide insight on novel therapeutic strategies for diverse neurological diseases.
Mechanistic studies of dendritic growth would be greatly facilitated by the availability of a model system that allows neurons to be experimentally switched from a state in which they do not extend dendrites to one in which they elaborate a dendritic arbor comparable to that of their in vivo counterparts. Primary cultures of sympathetic neurons dissociated from the superior cervical ganglia (SCG) of perinatal rodents provide such a model. When cultured in defined medium in the absence of serum and ganglionic glial cells, sympathetic neurons extend a single process which is axonal, and this unipolar state persists for weeks to months in culture 14,15. However, the addition of either bone morphogenetic protein-7 (BMP-7) 16,17 or Matrigel 18 to the culture medium triggers these neurons to extend multiple processes that meet the morphologic, biochemical and functional criteria for dendrites. Sympathetic neurons dissociated from the SCG of perinatal rodents and grown under defined conditions are a homogenous population of neurons 19 that respond uniformly to the dendrite-promoting activity of Matrigel, BMP-7 and other BMPs of the decapentaplegic (dpp) and 60A subfamilies 17,18,20,21. Importantly, Matrigel- and BMP-induced dendrite formation occurs in the absence of changes in cell survival or axonal growth 17,18.
Here, we describe how to set up dissociated cultures of sympathetic neurons derived from the SCG of perinatal rats so that they are responsive to the selective dendrite-promoting activity of Matrigel or BMPs.

We describe a protocol for using bone morphogenetic protein-7 (BMP-7) or Matrigel to selectively induce dendritic growth in primary sympathetic neurons dissociated from the superior cervical ganglia (SCG) of perinatal rats.

גרימת צמיחה הדנדריטים בנוירונים אוהדים מתורבתים

The shape of the dendritic arbor determines the total synaptic input a neuron can receive 1-3, and influences the types and distribution of these inputs ...

An Approach to Enhance Alignment and Myelination of Dorsal Root Ganglion Neurons

Axon regeneration is a chaotic process due largely to unorganized axon alignment. Therefore, in order for a sufficient number of regenerated axons to bridge the lesion site, properly organized axonal alignment is required. Since demyelination after nerve injury strongly impairs the conductive capacity of surviving axons, remyelination is critical for successful functioning of regenerated nerves. Previously, we demonstrated that mesenchymal stem cells (MSCs) aligned on a pre-stretch induced anisotropic surface because the cells can sense a larger effective stiffness in the stretched direction than in the perpendicular direction. We also showed that an anisotropic surface arising from a mechanical pre-stretched surface similarly affects alignment, as well as growth and myelination of axons. Here, we provide a detailed protocol for preparing a pre-stretched anisotropic surface, the isolation and culture of dorsal root ganglion (DRG) neurons on a pre-stretched surface, and show the myelination behavior of a co-culture of DRG neurons with Schwann cells (SCs) on a pre-stretched surface.

This protocol describes the isolation of dorsal root ganglion (DRG) neurons isolated from rats and the culture of DRG neurons on a static pre-stretched cell culture system to enhance axon alignment, with subsequent co-culture of Schwann Cells (SCs) to promote myelination.

גישת שפר מערך myelination של נוירונים שורש הגבה גנגליון

Axon regeneration is a chaotic process due largely to unorganized axon alignment. Therefore, in order for a sufficient number of regenerated axons to ...

Dorsal Root Ganglia Isolation and Primary Culture to Study Neurotransmitter Release

Dorsal root ganglia (DRG) contain cell bodies of sensory neurons. This type of neuron is pseudo-unipolar, with two axons that innervate peripheral tissues, such as skin, muscle and visceral organs, as well as the spinal dorsal horn of the central nervous system. Sensory neurons transmit somatic sensation, including touch, pain, thermal, and proprioceptive sensations. Therefore, DRG primary cultures are widely used to study the cellular mechanisms of nociception, physiological functions of sensory neurons, and neural development. The cultured neurons can be applied in studies involving electrophysiology, signal transduction, neurotransmitter release, or calcium imaging. With DRG primary cultures, scientists may culture dissociated DRG neurons to monitor biochemical changes in single or multiple cells, overcoming many of the limitations associated with in vivo experiments. Compared to commercially available DRG-hybridoma cell lines or immortalized DRG neuronal cell lines, the composition and properties of the primary cells are much more similar to sensory neurons in tissue. However, due to the limited number of cultured DRG primary cells that can be isolated from a single animal, it is difficult to perform high-throughput screens for drug targeting studies. In the current article, procedures for DRG collection and culture are described. In addition, we demonstrate the treatment of cultured DRG cells with an agonist of neuropeptide FF receptor type 2 (NPFFR2) to induce the release of peptide neurotransmitters (calcitonin gene-related peptide (CRGP) and substance P (SP)).

Dorsal root ganglia (DRG) primary cultures are frequently used to study physiological functions or pathology-related events in sensory neurons. Here, we demonstrate the use of lumbar DRG cultures to detect the release of neurotransmitters after neuropeptide FF receptor type 2 stimulation with a selective agonist.

בידוד גרעיני הבסיס העזוב והתרבות העיקריים ללמוד שחרור נוירוטרנסמיטר

Dorsal root ganglia (DRG) contain cell bodies of sensory neurons. This type of neuron is pseudo-unipolar, with two axons that innervate peripheral ...

Culturing Rat Sympathetic Neurons from Embryonic Superior Cervical Ganglia for Morphological and Proteomic Analysis

Sympathetic neurons from the embryonic rat superior cervical ganglia (SCG) have been used as an in vitro model system for peripheral neurons to study axonal growth, axonal trafficking, synaptogenesis, dendritic growth, dendritic plasticity and nerve-target interactions in co-culture systems. This protocol describes the isolation and dissociation of neurons from the superior cervical ganglia of E21 rat embryos, followed by the preparation and maintenance of pure neuronal cultures in serum-free medium. Since neurons do not adhere to uncoated plastic, neurons will be cultured on either 12 mm glass coverslips or 6-well plates coated with poly-D-lysine. Following treatment with an antimitotic agent (Ara-C, cytosine &#946;-D-arabinofuranoside), this protocol generates healthy neuronal cultures with less than 5% non-neuronal cells, which can be maintained for over a month in vitro. Although embryonic rat SCG neurons are multipolar with 5-8 dendrites in vivo; under serum-free conditions, these neurons extend only a single axon in culture and continue to be unipolar for the duration of the culture. However, these neurons can be induced to extend dendrites in the presence of basement membrane extract, bone morphogenetic proteins (BMPs), or 10% fetal calf serum. These homogenous neuronal cultures can be used for immunocytochemical staining and for biochemical studies. This paper also describes optimized protocol for immunocytochemical staining for microtubule associated protein-2 (MAP-2) in these neurons and for the preparation of neuronal extracts for mass spectrometry.

This paper describes the isolation and culturing of embryonic rat sympathetic neurons from the superior cervical ganglia. It also provides detailed protocols for immunocytochemical staining and for preparing neuronal extracts for mass spectrometric analysis.

חולדה Culturing נוירונים סימפטיים מגנגליה צוואר הרחם מעולה עוברית לניתוח מורפולוגי ופרוטונומי

Sympathetic neurons from the embryonic rat superior cervical ganglia (SCG) have been used as an in vitro model system for peripheral neurons to study ...

Isolation and Culture of Chick Ciliary Ganglion Neurons

Chick ciliary ganglia (CG) are part of the parasympathetic nervous system and are responsible for the innervation of the muscle tissues present in the eye. This ganglion is constituted by a homogenous population of ciliary and choroidal neurons that innervate striated and smooth muscle fibers, respectively. Each of these neuronal types regulate specific eye structures and functions. Over the years, neuronal cultures of the chick ciliary ganglia were shown to be effective cell models in the study of muscle-nervous system interactions, which communicate through cholinergic synapses. Ciliary ganglion neurons are, in its majority, cholinergic. This cell model has been shown to be useful comparatively to previously used heterogeneous cell models that comprise several neuronal types, besides cholinergic. Anatomically, the ciliary ganglion is localized between the optic nerve (ON) and the choroid fissure (CF). Here, we describe a detailed procedure for the dissection, dissociation and in vitro culture of ciliary ganglia neurons from chick embryos. We provide a step-by-step protocol in order to obtain highly pure and stable cellular cultures of CG neurons, highlighting key steps of the process. These cultures can be maintained in vitro for 15 days and, hereby, we show the normal development of CG cultures. The results also show that these neurons can interact with muscle fibers through neuro-muscular cholinergic synapses.

Chick ciliary ganglia (CG) are part of the parasympathetic nervous system. Neuronal cultures of chick CG neurons were shown to be effective cell models in the study of nerve muscle interactions. We describe a detailed protocol for the dissection, dissociation and in vitro culture of CG neurons from chick embryos.

בידוד ותרבות של צ'יק סילייון גנגליון נוירונים

Chick ciliary ganglia (CG) are part of the parasympathetic nervous system and are responsible for the innervation of the muscle tissues present in the ...

A Technique for Harvesting and Dissociating Dorsal Root Ganglia for Neuronal Cultures

Source: de Luca, A. C., et al., <a href="https://app-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/v/52543">Dorsal Root Ganglia Neurons and Differentiated Adipose-derived Stem Cells: An In Vitro Co-culture Model to Study Peripheral Nerve Regeneration.</a> J. Vis. Exp. (2015).
This video demonstrates a method for harvesting neurons from the dorsal root ganglia (DRG). DRG from a rat&#39;s spinal column is isolated, treated with enzymes, and then mechanically dissociated to obtain a single-cell suspension. The neurons are separated from glial cells using density gradient centrifugation and cultured in a growth medium.

טכניקה לקצירת וניתוק גרעיני שורש גבי עבור תרביות עצביות

All procedures involving sample collection have been performed in accordance with the institute&#39;s IRB guidelines.
1. Experimental Set-up

	Prior to ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Neuronal Culture Techniques

Primary Neuronal Culture

Establishing a Primary Dorsal Root Ganglia Cell Culture from a Rat Spinal Column

Source: Lin, Y., et al. <a href="https://app-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/v/57569">Dorsal Root Ganglia Isolation and Primary Culture to Study Neurotransmitter Release.</a> J. Vis. Exp. (2018).
This video demonstrates a technique for isolating and culturing dorsal root ganglia (DRG) cells from the rat spinal column. DRGs excised from the spinal column are treated with enzymes and mechanically dissociated to obtain a single-cell suspension. The cells are cultured in a medium containing inhibitors and growth factors that limit glial cell proliferation and promote neuronal growth, respectively.

הקמת תרבית תאי גרעיני שורש גבי ראשונית מעמוד השדרה של חולדה

All procedures involving animal samples have been reviewed and approved by the appropriate animal ethical review committee.
1. Collect Lumbar DRG from ...

Isolating Sensory Neurons and Co-Culturing with Natural Killer Cells

Harvest the DRGs into a 15-milliliter conical tube filled with 10 milliliters of ice-cold, supplemented DMEM. Then, centrifuge the preparation for 5 minutes at 200 g at room temperature, and remove the supernatant. Add 250 microliters of PBS containing 1 milligram per milliliter of collagenase IV and 2.4 units per milliliter Dispase too. Incubate this DRG with collagenase dispase solution for 80 minutes with mild agitation.
To inactivate the enzymes, add 5 milliliters of supplemented DMEM medium and centrifuge the solution at 200 g. After 5 minutes, gently remove the supernatant using a pipette and leave around 100 microliters of the supernatant to avoid unwanted cell loss. Next, add 1 milliliter supplemented DMEM into the cells and use a pipette gun and three glass Pasteur pipettes of decreasing sizes to gently triturate the DRG into a single-cell preparation.
Using a P200 pipette, add the triturated ganglia suspension containing the neurons onto the side of the tube into the BSA gradient. Then, set the acceleration and deceleration at the minimum to centrifuge the neuron containing the BSA gradient for 12 minutes at 200 g. Following the centrifugation, remove all the supernatant using a pipette and resuspend the cells in 500 microliters of neurobasal.
Plate 10,000 neurons per well in a laminin-coated flat-bottom 96-well plate. To allow the attachment of the neurons, incubate the 96-well plate overnight at 37 degrees Celsius. To start co-culturing, slowly remove the neurobasal from the neuron culture and add 105 NK cells per well to the neuron culture.