שיטה זו יכולה לסייע לענות על שאלות מפתח בתחום המחקר החושי, כגון nociception היקפי. היתרון העיקרי של טכני זה הוא כי חקירת המנגנון התאי של נוירונים חושיים עם המודל המדמה ביותר למצב פיזיולוגי. לאסוף את גנגליה שורש הגב המותני מתא המטען של חולדה בת שבועיים עד שלושה שבועות.
התחל על ידי ביצוע שני חתכים לאורך הצדדים של עמוד השדרה וחתך רוחבי אחד כדי לסמן את היקף rostral של עמוד השדרה המותני. לאחר מכן, השתמש מטלפים חיתוך עצם כדי להסיר את השרירים הגביים של עמוד השדרה. לאחר מכן, להסיר את החלק הגבי של החוליות ולחשוף את חוט השדרה.
לאחר מכן השתמש מספריים ניתוח מדפים כדי להסיר את חוט השדרה. זהה את DRG המותני על ידי ספירת חוליות מן הצלע האחרונה. דיאגרמה זו מציגה את מיקומי החוליות.
השתמש מספריים מיקרו כדי לאסוף את 12 DRG מותני דו צדדי מ L1 כדי L6. הסר את כל הסיבים העצביים המצורפים כדי לשפר את טוהר התרבות. מעבירים כל DRG מותני לצלחת תרבות של 35 מילימטר המכילה שני מיליליטר של מדיום נטול סרום קר כקרח. מעבירים את המנה המכילה DRG 35 מילימטר לתוך מכסה המנוע למינאר, ולשטוף את DRG עם מדיום ללא סרום שלוש פעמים על ידי פיפטה.
השתמש פינצטה סטרילית כדי להעביר את DRGs לצלחת תרבות חדשה 35 מילימטר המכיל שני מיליליטר של קולגנס סטרילי סוג 1A. מניחים את הרקמה בתסמת קולגנס באינקובטור תרבות הרקמה של 37 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות כדי להתחיל דיסוציאציה של התאים. לאחר הדגירה, הסר את תווי הקולגנס ושטף את ה- DRG שלוש פעמים בשני מיליליטר של תווי המלח המאוזנים של האנק.
לאחר מכן, מוסיפים שני מיליליטר של 0.05% טריפסין EDTA לפני המלחמה לצלחת, ולעכל את DRG באינקובטור במשך 30 דקות כמו קודם. לאחר העיכול, השתמש פיפטה זכוכית להעביר את שני מיליליטר של פתרון המכיל DRG לצינור צנטריפוגה 15 מיליליטר. DRG עשוי לדבוק פיפטה זכוכית כך שלב זה צריך להתבצע בזהירות.
ההפסד בפועל ניתן להימנע על ידי שמירה על פתרון המכיל DRG בקצה המתחדד של פיפטה זכוכית, והעברת הפתרון לתוך צינור צנטריפוגה לאט אבל ללא הפסקה. לאחר מכן, צנטריפוגה הפתרון ב 290 פעמים G במשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס. לאחר צנטריפוגה, להסיר את supernatant ולהוסיף עוד שני מיליליטר של מדיום ללא סרום כדי לעשות שימוש חוזר DRG.
חזור על הכביסה פעמיים, באמצעות שני מיליליטר של מדיום תרבות טרום המלחמה כדי resuspend הרקמה לאחר הצנטריפוגה הסופית. השתמשו בצנרת המלוטשת של להבה סטרילית שהוכנה בעבר כדי להפוך את ה-DRG לטריטוריה ידנית כ-60 פעמים. לאחר מכן, הסר צלחת פולי-L-ליסין מצופה 24 באר המכילה מיליליטר אחד של מדיום תרבות ל הבאר מהאינקובטור CO2.
שאפו את מדיום התרבות הדגירה מהמנה. זרע את תאי DRG מעכברוש אחד לארבע בארות. זה נותן צפיפות זריעה של כ 500, 000 תאים לגם.
למחרת, להחליף את מדיום התרבות עם בינוני בתוספת 10 micromolar AraC, ו 100 ננוגרם למיליליטר NGF. ביום השלישי לאחר ציפוי התא, לשנות את המדיום ל 0.5 מיליליטר של מדיום נטול סרום מראש, ו דגירה במשך שעה אחת. במהלך הדגירה, מוסיפים 50 מילימולרים siRNA במיקרוליטר אחד של מים נטולי RNase ל-12.5 מיקרוליטרים של מדיום ללא סרום לכל טרנספייפ.
לאחר מכן פיפטה 2.5 microliters של reagent transfection לתוך 10 microliters של מדיום ללא סרום עבור כל transfection. ערבבו את שני הפתרונות לפי פיפט, והתערבבו בתספורת מעורבת זו במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר 10 דקות, מוסיפים את תספורת ההטרדה לתוך בארות של צלחת 24 באר המכילה DRG ומערבבים על ידי טלטול בעדינות.
לאחר דגירה של שש שעות, הוסיפו 0.5 מיליליטר של מדיום תרבותי עם 20%FBS, 10 מיקרומולרים AraC ו-100 ננוגרם למיליליטר NGF לכל באר של תאים. לבסוף, חודרים את DRG ב 37 מעלות צלזיוס CO2 אינקובטור במשך 66 שעות נוספות. ביום השישי לאחר ציפוי, ו 72 שעות לאחר transfection siRNA, לשנות את מדיום התרבות ל 200 microliters של מדיום ללא סרום.
לאחר דגירה של 30 דקות, מוסיפים מיקרוליטר אחד של הכימיקל הגירוי ומערבבים בעדינות על ידי צינורות. אגוניסט NPFFR2, dNPA, ורכב מתאים משמשים כאן. לאחר הדגירה לתקופה הנדרשת, לאסוף את מדיום התרבות מן צלחת התרבות, צנטריפוגה ב 5000 פעמים G במשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס כדי להסיר את כל זיהומים מושעה.
לאסוף את supernatant מן הצנטריפוגה לדלל עם מלוחים מאגר פוספט לפי הצורך. תן לי את רמות הנוירוטרנסמיטורים עם ערכות אימונואזי אנזימים זמינות מסחרית. ביום הראשון, גוף התא של נוירון יחיד שצוין על ידי החץ היה מחובר בתחתית צלחת.
כמו כן קיים תא גליה המצוין על-ידי ראש חץ. תאי הגלישה שכפלו והרחיבו תהליכים כדי להקיף את גוף התא של הנוירון החושי ביום השני, תהליך שהיה בולט עוד יותר ביום השלישי. בתרבות אחרת, חלבון CGRP היה מוכתם כדי לחשוף את הצורה של נוירונים.
כתמי חלבון CGRP מופיעים בציטופלסמה ובאקסונים של נוירונים חושיים. מורולוגיות גרעיניות של נוירונים ותאי גלייה מובחנים כאשר מוכתמים ב- DAPI. לנוירונים יש גרעין גדול ועגול יותר מתאי גליה.
לשם השוואה, הגרעינים של גליה הם אליפסה יותר בכושר. לאחר השליטה, טכניקה זו יכולה להיעשות בעוד שעתיים וחצי אם היא מבוצעת כראוי. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה צריך הבנה טובה של איך לנתח ולתרבת את גנגליון השורש הגבי, ולהשתמש בו ככלי לחקור פונקציות פיזיולוגיות הבסיסית.
אל תשכח כי עבודה עם תאים ראשוניים יכול להיות הרבה יותר קשה מאשר לעבוד עם קווי תאים רגילים, ולהיות עדין היא תמיד הדרך הטובה ביותר בעת ביצוע הליך זה.
