פתרונות <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתרון תאיים בתאי הגנגליון (מ&quot;מ): 100-K-gluconate, 8 KCl, 1 MgCl 2, 1 EGTA, 10 HEPES, 4 ATP, GTP 0.5, 90 מיקרומטר Sulforhodamine B (עבור כתמים), מותאם pH = 7.4 עם KOH </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתרון תאיים עבור תאים דו קוטבית (מ&quot;מ): 90 K-gluconate, 8 KCl, 1 MgCl 2, 10 BAPTA, 10 HEPES, 4 ATP, GTP 0.5, 90 מיקרומטר Sulforhodamine B (עבור כתמים), מותאם pH = 7.4 עם KOH </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רינגר תאיים של פתרון (מ&quot;מ): 112 NaCl, גלוקוז 5, 5 HEPES, 2 KCl, 2 CaCl 2, 1 MgCl 2, מותאם pH = 7.75 עם NaOH. חמצון של הפתרון אינו הכרחי. </li></ul> הכן חדרי הקלטה חדר הקלטה שלנו מורכבת של המיקרוסקופ שקופית עם דבק גם בו בלוקים סיליקון קטן לגזור דבק אחר גם ממוקמים לספק יציבות עבור פרוסות הרקמה. הכנת פרוסות רשתית כדי למנוע הלבנת של קולטני האור, החיתוך מתבצע באור אינפרא אדום או אור אדום עמום. אם מישהו מעוניין הקלטה ותגובות מסלול מוט, רק אור IR יש להשתמש (IR לנתח מיקרוסקופ ואין אור בחדר. נוספות משקפי IR יש להשתמש הליכים לא נעשה תחת המיקרוסקופ). אם מישהו מתעניין בעיקר הקלטה אור חרוט התגובות, חדר אפלולי אור אדום או אור אדום פלאש יכול לשמש. מיקרוסקופ עם זאת, עדיין צריך להיות oculars IR. אם קלט photoreceptor אינה רלוונטית לצורך הניסוי, ההליכים יכולים להתבצע באור חדר רגיל באמצעות מיקרוסקופ רגיל. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכינו שתי שקופיות מיקרוסקופ עם סיליקון דבק טוב: ליצור שתי רצועות מקבילות של גריז סיליקון (כ 0.5 ס&quot;מ זה מזה) בכל שקופית ומקום חתיכה מלבנית של נייר סינון בצד אחד של השקופית, המעבר הן להקות שומן (לדחוף את המסנן נייר חלק סכין גילוח, כך הוא מחובר היטב לשקופית) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הקורבן סלמנדרה על פי פרוטוקולים הקמה: החיה ממוקם באמבט קרח במשך 30 דקות, הכרות אז פעמיים דקורה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסרת עין מהראש סלמנדרה ולמקם אותו תחת מיקרוסקופ לנתח על פיסת נייר טבולה פתרון קר כקרח רינגר </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסרה של רקמת חיבור מהעין </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש סכין גילוח לעשות חתך קטן בקרנית </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החזק חתך בקרנית עם מלקחיים תוך הסרת אותו במספריים לאורך מצורף שלה לעין </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוציאים את העדשה עם מלקחיים </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החזק את אירוס עם מלקחיים חתך לאורך serrata אורה להסיר את הקשתית </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותכים את עיינית לשני חלקים מלבניים </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרים את אחד החלקים ולמקם אותו בצד sclera על נייר המסנן (לוודא לשטח את היצירה בעודה דוחפת אותו בזהירות רבה) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות להרים את sclera את הרשתית, אשר כעת אמור להיות מצורף הנייר filer </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף במהירות פתרון קר כקרח רינגר אל הבאר </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור זהה עבור פיסת השני </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש סכין גילוח להציב מבצעה בהתאמה אישית לקצץ 200-300μm פרוסות רחב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש זוג מלקחיים להרים את פרוסות בצד של נייר הסינון, להפוך אותם על כך את השכבות של הרשתית להיות גלוי, ומניחים אותם על להקות גריז ואקום </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחרו פרוסה שנראית ניזוק ומראה להקות אופקי המציין את השכבות של הרשתית (השכבות הם לפעמים קשה לראות מתחת למיקרוסקופ לנתיחה כמו ההגדלה אינו גבוה מספיק, אולם אם אפשר לזהות כמה שכבות פרוסה הוא בדרך כלל מספיק טוב. ההחלטה הסופית בשאלה אם להשתמש פרוסה עם זאת, הוא עשה פעם אחת הוא מוצג תחת מיקרוסקופ זקוף). הזז אותו כדי להחליק את תא הקלטת על ידי בניית גשר Ringer בין שתי שקופיות </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ודא שהנייר לסנן נדחף כנגד קוביות גומי בחדר הקלטה כך פרוסה אינו מוטה (תאים הגנגליון ו photoreceptors צריך להיות בפוקוס באותו זמן) </li></ol> הצבת את הרקמה במתקן ההקלטה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שקופית ההקלטה ממוקם מתחת למיקרוסקופ ואת perfused עם פתרונות של רינגר דרך syste זלוף הכבידה </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ההכנה היא דמיינו עם מיקרוסקופ זקוף עם מטרה 10x ו 40X טבילה במים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שוב, אנו רק להשתמש באור אינפרא אדום כדי למנוע הלבנת של photoreceptors. מצלמת IR מחובר ליציאה הצדדית של המיקרוסקופ, אשר מחובר למסך טלוויזיה. </li></ol> גירוי חזותי גירויים חזותיים מתוכנתים ב-Matlab באמצעות Psychtoolbox הם מוקרנת על רשתית העין באמצעות יציאת העליון של המיקרוסקופ באמצעות תמונה מיקרוסקופית ההזרקה (Mbf במדעי החיים). Bits + + מעבד וידאו דיגיטלי (Cambridge Research Systems) משמש כדי לקבל קנה מידה בהיקות 14bit ו synchronize מצגת גירוי עם רכישת נתונים. גירויים חזותיים המשמשים זה וידאו ברים בהירות או כהות (רוחב = 460μm) של 100% לעומת זאת, שהוצגו במשך שתי שניות על רקע אחיד קבוע (בהיקות = 8 * 10 4 פוטונים / מיקרומטר / s, גודל: 1.84 x 1.38mm). Electrophysiology <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אלקטרודות תיקון המגיעים בורוסיליקט זכוכית (OD:.. מזהה 1.5mm, 84mm) עם חולץ micropipette. עבור תאים הגנגליון, התנגדויות הם בין 2 ל 4 MOhms. עבור תאים דו קוטבית, התנגדות גבוהה יותר בין 4 ל 8 MOhms משמשים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הקלטות קלאמפ מתח מבוצעות באמצעות 700A Multiclamp (התקנים מולקולריים), מגבר ותוכנה מעבדה פנימי מתוכנת LabVIEW. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סמים הם perfused דרך מערכת ערוץ 8-זלוף. אלקטרודה microperfusion ממוקם קרוב הפרוסה (רקמת צריך לעבור לעין כאשר אתה מסובב את זלוף לסירוגין, אבל צריך להיות זהירים כי הלחץ אינו חזק מדי, כך פרוסה יכולה להיות מנותקת נייר הסינון). במהלך הניסויים microperfusion צריך להיות מופעל כל הזמן (פתרון בקרת המרוססת אם אין סמים יש צורך), כך ההקלטה אינה מקבלת מופרע על ידי החלפת זלוף לסירוגין. </li></ul>

<ol>
	<li>Cook, P. B., Lukasiewicz, P. D., McReynnolds, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GABA(C)+receptors+control+adaptive+changes+in+a+glycinergic+inhibitory+pathway+in+salamander+retina.">GABA(C) receptors control adaptive changes in a glycinergic inhibitory pathway in salamander retina.</a> Journal of Neuroscience. 20, 806-812 (2000).</li><li>Heflin, S. J., Cook, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Narrow+and+wide+field+amacrine+cells+fire+action+potentials+in+response+to+depolarization+and+light+stimulation.">Narrow and wide field amacrine cells fire action potentials in response to depolarization and light stimulation.</a> Visual Neuroscience. 24, 197-206 (2007).</li><li>Ichinose, T., Shields, C. R., Lukasiewicz, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sodium+Channels+in+the+Transient+Retinal+Bipolar+Cells+Enhance+Visual+Responses+in+Ganglion+Cells.">Sodium Channels in the Transient Retinal Bipolar Cells Enhance Visual Responses in Ganglion Cells.</a> J Neurosci.. 25, 1856-1865 (2005).</li></ol>

יתרונות: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כל סוגי תאים נגישים </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זיהוי קל של סוגי תאים, בפרט אם פלורסנט לצבוע מתווסף פתרון האלקטרודה </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סוכני תרופתי יכול בקלות להגיע תאים היעד </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הטכניקה מהדק התיקון מאפשר לחקור את התפקיד של תעלות יונים שונים חישובים הרשתית. מידע אותו לא ניתן להשיג באמצעות הקלטות extracelluar ספייק או הקלטות עם אלקטרודות חדה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טכניקה זו ניתן ליישם מודלים של בעלי חיים אחרים </li></ol> חסרונות: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תהליכים עשוי לקבל לנתק בתהליך של חיתוך. לכן, מחקרים המתמקדים בתחום פתוח מרחבי עלול להיות קשה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כמו ברשתית ביותר בהכנות חוץ גופית המשמשת electrophysiology, אפיתל הפיגמנט מוסר, מה שעלול להוביל להלבנה של photoreceptors. מחקרים הדורשים גירוי עם עוצמות אור גבוהות או צורך ללמוד את הרשתית לפי מדינות הסתגלות רבים עלול להיתקל בקשיים עם טכניקה זו. </li></ol>

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Multiclamp 700A</td>
<td>Patch Clamp Amplifier</td>
<td>Molecular Devices</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>SZX9</td>
<td>Dissection Micropscope</td>
<td>Olympus</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>BX50WI</td>
<td>Upright Microscope</td>
<td>Olympus</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Equipped with 40x, 10x water immersion objective, fluorescent filters and mercury lamp</td>
</tr>
<tr>
<td>P-97</td>
<td>Micropipette Puller</td>
<td>Sutter Instruments</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Lucivid</td>
<td>Microscope image injector</td>
<td>Mbf bioscience</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>8-channel perfusion system</td>
<td>Microperfusion</td>
<td>Parker Hannfin corporation</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Bits++</td>
<td>Digital Video Processor</td>
<td>Cambridge Research Systems</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Infrared Oculars</td>
<td>Other</td>
<td>ITT</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Adhesive silicone wells</td>
<td>Other</td>
<td>Molecular Probes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>20mm diameter, 1.0mm deep</td>
</tr>
<tr>
<td>Membrane Filters</td>
<td>Filter</td>
<td>Milipore</td>
<td>HAWPO1300</td>
<td>.45&#181;m HA</td>
</tr>
<tr>
<td>Borosilicate Glass Capillaries</td>
<td>Electrode glass</td>
<td>World Precision Instruments</td>
<td>1B150-4</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Syringe Filters</td>
<td>Filter</td>
<td>Whatman</td>
<td>6789-0402</td>
<td>4mm filters, .2um Nylon Membrane, Polypropylene housing</td>
</tr>
<tr>
<td>IR camera</td>
<td>Micropscope mounted camera</td>
<td>Sony</td>
<td>SPT-M324</td>
<td>Extrawave HAD, B7W video camera</td>
</tr>
<tr>
<td>Picrotoxin</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>P1675</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Strychnine</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>S0532</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Imidazole-4-acetic acid sodium salt</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>I7013</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Larval tiger salamanders</td>
<td>Animal</td>
<td>Charles E. Sullivan (Nashville, TN)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

whole-cell recordings of light evoked excitatory synaptic currents in the retinal slice

אנו משתמשים כל תא מהדק טכניקה טלאי ללמוד את המעגלים הסינפטי שבבסיס עיבוד המידע החזותי ברשתית. בסרטון הזה, אנו נדריך אותך בתהליך של ביצוע כל תא הקלטות של זרמים מעוררים אור של תאים בודדים בהכנת פרוסה הרשתית. אנו משתמשים נמר מימיים כמו סלמנדרה במודל חיה. נתחיל בתיאור דיסקציה של העין ולהראות כמה פרוסות מורכבים עבור הקלטות אלקטרו. לאחר פרוסה ממוקמת בחדר ההקלטה, אנו מדגימים כיצד לבצע כל תא מהדק הקלטות מתח. לאחר מכן, אנו הפרויקט גירויים חזותיים על photoreceptors של הפרוסה לעורר אור עורר תגובות הנוכחי. במהלך ההקלטה אנו perfuse את הפרוסה עם סוכני תרופתי, לפיה מערכת ערוץ 8-זלוף מאפשר לנו לעבור במהירות בין סוכנים שונים. הכנה פרוסה רשתית נעשה שימוש נרחב הרשתית עבור הקלטות מהדק תיקון, בפרט ללמוד amacrine או תאים דו קוטבית, אשר אינם נגישים בהכנת כל הר.

Watch this Scientific Journal Video about Whole-cell Recordings of Light Evoked Excitatory Synaptic Currents in the Retinal Slice at JoVE.com

Whole-cell Recordings of Light Evoked Excitatory Synaptic Currents in the Retinal Slice

וידאו זה מציג את התהליך של כל תא מהדק הקלטות מתח הפרוסה הרשתית של נמר מימיים סלמנדרה. אנו מדגימים את הכנת הפרוסה וכן כיצד לבצע הקלטות מהדק תיקון במהלך גירוי ויזואלי של הרשתית.

שלמות התא הקלטות של אור עורר זרמים Synaptic מעוררים פורסים את רשתית

We use the whole-cell patch clamp technique to study the synaptic circuitry that underlies visual information processing in the retina. In this video, we ...

whole-cell-recordings-light-evoked-excitatory-synaptic-currents

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

12.7K Views.  Boston University. וידאו זה מציג את התהליך של כל תא מהדק הקלטות מתח הפרוסה הרשתית של נמר מימיים סלמנדרה. אנו מדגימים את הכנת הפרוסה וכן כיצד לבצע הקלטות מהדק תיקון במהלך גירוי ויזואלי של הרשתית.

Video: Whole-cell Recordings of Light Evoked Excitatory Synaptic Currents in the Retinal Slice

Horizontal Slice Preparation of the Retina

Traditionally the vertical slice and the whole-mount preparation of the retina have been used to study the function of retinal circuits. However, many of retinal neurons, such as amacrine cells, expand their dendrites horizontally, so that the morphology of the cells is supposed to be severely damaged in the vertical slices. In the whole-mount preparation, especially for patch-clamp recordings, retinal neurons in the middle layer are not easily accessible due to the extensive coverage of glial cell (Mueller cell) s endfeets. Here, we describe the novel slicing method to preserve the dendritic morphology of retinal neurons intact. The slice was made horizontally at the inner layer of the retina using a vibratome slicer after the retina was embedded in the low-temperature melting agarose gel. In this horizontal slice preparation of the retina, we studied the function of retinal neurons compared with their morphology, by using patch-clamp recording, calcium imaging technique, immunocytochemistry, and single-cell RT-PCR.

Traditionally the vertical slice and the whole-mount preparation of the retina have been used to study the function of retinal circuits. Here, we describe the novel slicing method to preserve the dendritic morphology of retinal neurons intact.

פורסים הכנה אופקי של הרשתית

Traditionally the vertical slice and the whole-mount preparation of the retina have been used to study the function of retinal circuits. However, many of ...

Whole Cell Recordings from Brain of Adult Drosophila

In this video, we demonstrate the procedure for isolating whole brains from adult Drosophila in preparation for recording from single neurons. We begin by describing the dissecting solution and capture of the adult females used in our studies. The procedure for removing the whole brain intact, including both optic lobes, is illustrated. Dissection of the overlying trachea is also shown.  The isolated brain is not only small but needs special care in handling at this stage to prevent damage to the neurons, many of which are close to the outer surface of the tissue. We show how a special holder we developed is used to stabilize the brain in the recording chamber. A standard electrophysiology set up is used for recording from single neurons or pairs of neurons. A fluorescent image, viewed through the recording microscope, from a GAL4 line driving GFP expression (GH146) illustrates how projection neurons (PNs) are identified in the live brain. A high power Nomarski image shows a view of a single neuron that is being targeted for whole cell recording. When the brain is successfully removed without damage, the majority of the neurons are spontaneously active, firing action potentials and/or exhibiting spontaneous synaptic input. This in situ preparation, in which whole cell recording of identified neurons in the whole brain can be combined with genetic and pharmacological manipulations, is a useful model for exploring cellular physiology and plasticity in the adult CNS.

This video demonstrates the procedure for isolating whole brains from adult Drosophila in preparation for recording from single neurons using standard whole cell technology. It includes images of GFP labeled cells and neurons viewed during recording.

תא הקלטות שלמות של המוח של מבוגרים תסיסנית

In this video, we demonstrate the procedure for isolating whole brains from adult Drosophila in preparation for recording from single neurons. We begin by ...

Major Components of the Light Microscope

The light microscope is a basic tool for the cell biologist, who should have a thorough understanding of how it works, how it should be aligned for different applications, and how it should be maintained as required to obtain maximum image-forming capacity and resolution. The components of the microscope are described in detail here.

The light microscope is a basic tool for the cell biologist, who should have a thorough understanding of how it works, how it should be aligned for different applications, and how it should be maintained as required to obtain maximum image-forming capacity and resolution. The components of the microscope are described in detail here.

הרכיבים העיקריים של מיקרוסקופ אור

The light microscope is a basic tool for the cell biologist, who should have a thorough understanding of how it works, how it should be aligned for ...

Single-cell Suction Recordings from Mouse Cone Photoreceptors

Rod and cone photoreceptors in the retina are responsible for light detection. In darkness, cyclic nucleotide-gated (CNG) channels in the outer segment are open and allow cations to flow steadily inwards across the membrane, depolarizing the cell. Light exposure triggers the closure of the CNG channels, blocks the inward cation current flow, and thus results in cell hyperpolarization. Based on the polarity of photoreceptors, a suction recording method was developed in 1970s that, unlike the classic patch-clamp technique, does not require penetrating the plasma membrane 1. Drawing the outer segment into a tightly-fitting glass pipette filled with extracellular solution allows recording the current changes in individual cells upon test-flash exposure. However, this well-established "outer-segment-in (OS-in)" suction recording is not suitable for mouse cone recordings, because of the low percentage of cones in the mouse retina (3%) and the difficulties in identifying the cone outer segments. Recently, an inner-segment-in (IS-in) recording configuration was developed to draw the inner segment/nuclear region of the photoreceptor into the recording pipette 2,3. In this video, we will show how to record from individual mouse cone photoresponses using single-cell suction electrode.

We will show how to record flash responses from single mouse cones using a suction electrode.

תא בודד יניקה הקלטות של photoreceptors קון עכבר

Rod and cone photoreceptors in the retina are responsible for light detection. In darkness, cyclic nucleotide-gated (CNG) channels in the outer segment ...

Whole-Cell Recording of Calcium Release-Activated Calcium (CRAC) Currents in Human T Lymphocytes

In T lymphocytes, depletion of Ca2+ from the intracellular Ca2+ store leads to activation of plasmalemmal Ca2+ channels, called Calcium Release-Activated Calcium (CRAC) channels. CRAC channels play important role in regulation of T cell proliferation and gene expression. Abnormal CRAC channel function in T cells has been linked to severe combined immunodeficiency and autoimmune diseases 1, 2 . Studying CRAC channel function in human T cells may uncover new molecular mechanisms regulating normal immune responses and unravel the causes of related human diseases. Electrophysiological recordings of membrane currents provide the most accurate assessment of functional channel properties and their regulation. Electrophysiological assessment of CRAC channel currents in Jurkat T cells, a human leukemia T cell line, was first performed more than 20 years ago 3, however, CRAC current measurements in normal human T cells remains a challenging task. The difficulties in recording CRAC channel currents in normal T cells are compounded by the fact that blood-derived T lymphocytes are much smaller in size than Jurkat T cells and, therefore, the endogenous whole-cell CRAC currents are very low in amplitude. Here, we give a step-by-step procedure that we routinely use to record the Ca2+ or Na+ currents via CRAC channels in resting human T cells isolated from the peripheral blood of healthy volunteers. The method described here was adopted from the procedures used for recording the CRAC currents in Jurkat T cells and activated human T cells 4-8.

Whole-Cell Recording of Calcium Release-Activated Calcium CRAC Currents in Human T Lymphocytes

We provide a step-by-step protocol for whole-cell patch clamp recording of Calcium Release-Activated Calcium (CRAC) currents in peripheral blood mononuclear cell-derived human T lymphocytes.

Whole Cell-הקלטה של ​​סידן סידן שחרור פעילה (CRAC) זרמים האדם לימפוציטים-T

In T lymphocytes, depletion of Ca2+ from the intracellular Ca2+ store leads to activation of plasmalemmal Ca2+ channels, called Calcium Release-Activated ...

Studying Proteolysis of Cyclin B at the Single Cell Level in Whole Cell Populations

Equal distribution of chromosomes between the two daughter cells during cell division is a prerequisite for guaranteeing genetic stability 1. Inaccuracies during chromosome separation are a hallmark of malignancy and associated with progressive disease 2-4. The spindle assembly checkpoint (SAC) is a mitotic surveillance mechanism that holds back cells at metaphase until every single chromosome has established a stable bipolar attachment to the mitotic spindle1. The SAC exerts its function by interference with the activating APC/C subunit Cdc20 to block proteolysis of securin and cyclin B and thus chromosome separation and mitotic exit. Improper attachment of chromosomes prevents silencing of SAC signaling and causes continued inhibition of APC/CCdc20 until the problem is solved to avoid chromosome missegregation, aneuploidy and malignant growths1.
Most studies that addressed the influence of improper chromosomal attachment on APC/C-dependent proteolysis took advantage of spindle disruption using depolymerizing or microtubule-stabilizing drugs to interfere with chromosomal attachment to microtubules. Since interference with microtubule kinetics can affect the transport and localization of critical regulators, these procedures bear a risk of inducing artificial effects 5.
To study how the SAC interferes with APC/C-dependent proteolysis of cyclin B during mitosis in unperturbed cell populations, we established a histone H2-GFP-based system which allowed the simultaneous monitoring of metaphase alignment of mitotic chromosomes and proteolysis of cyclin B 6.
To depict proteolytic profiles, we generated a chimeric cyclin B reporter molecule with a C-terminal SNAP moiety 6 (Figure 1). In a self-labeling reaction, the SNAP-moiety is able to form covalent bonds with alkylguanine-carriers (SNAP substrate) 7,8 (Figure 1). SNAP substrate molecules are readily available and carry a broad spectrum of different fluorochromes. Chimeric cyclin B-SNAP molecules become labeled upon addition of the membrane-permeable SNAP substrate to the growth medium 7 (Figure 1). Following the labeling reaction, the cyclin B-SNAP fluorescence intensity drops in a pulse-chase reaction-like manner and fluorescence intensities reflect levels of cyclin B degradation 6 (Figure 1). Our system facilitates the monitoring of mitotic APC/C-dependent proteolysis in large numbers of cells (or several cell populations) in parallel. Thereby, the system may be a valuable tool to identify agents/small molecules that are able to interfere with proteolytic activity at the metaphase to anaphase transition. Moreover, as synthesis of cyclin B during mitosis has recently been suggested as an important mechanism in fostering a mitotic block in mice and humans by keeping cyclin B expression levels stable 9,10, this system enabled us to analyze cyclin B proteolysis as one element of a balanced equilibrium 6.

Metaphase to anaphase transition is triggered through anaphase-promoting complex (APC/C)-dependent ubiquitination and subsequent destruction of cyclin B. Here, we established a system which, following pulse-chase labeling, allows monitoring cyclin B proteolysis in entire cell populations and facilitates the detection of interference by the mitotic checkpoint.

לומד Proteolysis של cyclin B ברמת התא הבודד באוכלוסיות תאים שלמות

Equal distribution of chromosomes between the two daughter cells during cell division is a prerequisite for guaranteeing genetic stability 1. Inaccuracies ...

The Slice Culture Method for Following Development of Tooth Germs In Explant Culture

Explant culture allows manipulation of developing organs at specific time points&#160;and is therefore an important method for the developmental biologist. For many organs it is difficult to access developing tissue to allow monitoring during ex vivo culture. The slice culture method allows access to tissue so that morphogenetic movements can be followed and specific cell populations can be targeted for manipulation or lineage tracing.
In this paper we describe a method of slice culture that has been very successful for culture of tooth germs in a range of species. The method provides excellent access to the tooth germs, which develop at a similar rate to that observed in vivo, surrounded by the other jaw tissues. This allows tissue interactions between the tooth and surrounding tissue to be monitored. Although this paper concentrates on tooth germs, the same protocol can be applied to follow development of a number of other organs, such as salivary glands, Meckel&#39;s cartilage, nasal glands, tongue, and ear.

Here we detail a method to culture tooth germs in mandible slices using a tissue chopper. This method allows unique access to the tooth during development, providing excellent opportunity for manipulation and lineage tracing, not available using more traditional culture methods.

פורסים תרבות השיטה למעקב אחר ההתפתחות של חיידקים בשיני explant תרבות

Explant culture allows manipulation of developing organs at specific time points&#160;and is therefore an important method for the developmental ...

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

We developed and validated a fluorescent marking methodology for clonal tracking of hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) with high spatial and temporal resolution to study in vivo hematopoiesis using the murine bone marrow transplant experimental model. Genetic combinatorial marking using lentiviral vectors encoding fluorescent proteins (FPs) enabled cell fate mapping through advanced microscopy imaging. Vectors encoding five different FPs: Cerulean, EGFP, Venus, tdTomato, and mCherry were used to concurrently transduce HSPCs, creating a diverse palette of color marked cells. Imaging using confocal/two-photon hybrid microscopy enables simultaneous high resolution assessment of uniquely marked cells and their progeny in conjunction with structural components of the tissues. Volumetric analyses over large areas reveal that spectrally coded HSPC-derived cells can be detected non-invasively in various intact tissues, including the bone marrow (BM), for extensive periods of time following transplantation. Live studies combining video-rate multiphoton and confocal time-lapse imaging in 4D demonstrate the possibility of dynamic cellular and clonal tracking in a quantitative manner.

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

Combinatorial 5 fluorescent proteins marking of hematopoietic stem and progenitor cells allows in vivo clonal tracking via confocal and two-photon microscopy, providing insights into bone marrow hematopoietic architecture during regeneration. This method allows non-invasive fate mapping of spectrally-coded HSPCs-derived cells in intact tissues for extensive periods of time following transplantation.

במשובט מעקב vivo של גזע hematopoietic ובתאים המסומנים על ידי חמישה חלבונים ניאון באמצעות Confocal וmultiphoton מיקרוסקופית

We developed and validated a fluorescent marking methodology for clonal tracking of hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) with high spatial and ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) maintain the turnover of all mature blood cell lineages. The coordination of the complex signals leading to specific HSC fates relies upon the interaction between HSCs and the intricate bone marrow microenvironment, which is still poorly understood[1-2].
We describe how by combining a newly developed specimen holder for stable animal positioning with multi-step confocal and two-photon in vivo imaging techniques, it is possible to obtain high-resolution 3D stacks containing HSPCs and their surrounding niches and to monitor them over time through multi-point time-lapse imaging. High definition imaging allows detecting ex vivo labeled hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) residing within the bone marrow. Moreover, multi-point time-lapse 3D imaging, obtained with faster acquisition settings, provides accurate information about HSPC movement and the reciprocal interactions between HSPCs and stroma cells.
Tracking of HSPCs in relation to GFP positive osteoblastic cells is shown as an exemplary application of this method. This technique can be utilized to track any appropriately labeled hematopoietic or stromal cell of interest within the mouse calvarium bone marrow space.

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

The nature of the interactions between hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) and bone marrow niches is poorly understood. Custom hardware modifications and a multi-step acquisition protocol allow the use of two-photon and confocal microscopy to image ex vivo labeled HSPCs homed within bone marrow areas, tracking interactions and movement.

במעקב 4 ממדי Vivo של תאי גזע ואבות היווצרות דם במבוגרי עכבר calvarial מח עצם

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Method for the Assessment of Effects of a Range of Wavelengths and Intensities of Red/near-infrared Light Therapy on Oxidative Stress In Vitro

Red/near-infrared light therapy (R/NIR-LT), delivered by laser or light emitting diode (LED), improves functional and morphological outcomes in a range of central nervous system injuries in vivo, possibly by reducing oxidative stress. However, effects of R/NIR-LT on oxidative stress have been shown to vary depending on wavelength or intensity of irradiation. Studies comparing treatment parameters are lacking, due to absence of commercially available devices that deliver multiple wavelengths or intensities, suitable for high through-put in vitro optimization studies. This protocol describes a technique for delivery of light at a range of wavelengths and intensities to optimize therapeutic doses required for a given injury model. We hypothesized that a method of delivering light, in which wavelength and intensity parameters could easily be altered, could facilitate determination of an optimal dose of R/NIR-LT for reducing reactive oxygen species (ROS) in vitro.
Non-coherent Xenon light was filtered through narrow-band interference filters to deliver varying wavelengths (center wavelengths of 440, 550, 670 and 810nm) and fluences (8.5 x 10-3 to 3.8 x 10-1 J/cm2) of light to cultured cells. Light output from the apparatus was calibrated to emit therapeutically relevant, equal quantal doses of light at each wavelength. Reactive species were detected in glutamate stressed cells treated with the light, using DCFH-DA and H2O2 sensitive fluorescent dyes.&#160;
We successfully delivered light at a range of physiologically and therapeutically relevant wavelengths and intensities, to cultured cells exposed to glutamate as a model of CNS injury. While the fluences of R/NIR-LT used in the current study did not exert an effect on ROS generated by the cultured cells, the method of light delivery is applicable to other systems including isolated mitochondria or more physiologically relevant organotypic slice culture models, and could be used to assess effects on a range of outcome measures of oxidative metabolism.

Method for the Assessment of Effects of a Range of Wavelengths and Intensities of Red/near-infrared Light Therapy on Oxidative Stress In Vitro

Non-coherent Xenon light was passed through narrow-band interference and neutral density filters to deliver light of varying wavelength and intensity to cultured cells. This protocol was used to assess the effects of red/near-infrared light therapy on production of reactive species in vitro: no effects were observed using the tested parameters.

שיטה להערכת ההשפעות של טווח של אורכי גל ועוצמות של אדום / טיפול באור האינפרה-אדום קרוב בסטרס חמצוני<em&gt; במבחנה</em

Red/near-infrared light therapy (R/NIR-LT), delivered by laser or light emitting diode (LED), improves functional and morphological outcomes in a range of ...