שלב 1: להפשיר 293 תאים צלחת לייצור lentivirus. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 9 מ&quot;ל של מדיום + DMEM בצינור 15 מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר בקבוקון של 293 מניות קפוא מהטנק חנקן נוזלי ולשים את הבקבוקון בתוך אמבט המים 37 מעלות צלזיוס עד התאים ביותר (אך לא כולם) הם הפשירו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסרת תאים מבקבוקון מקום מקפיא לשפופרת 15 מ&quot;ל של שלב 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה ב 180g במשך 5 דקות, ולאחר מכן למחוק את supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend התאים עם 10 מ&quot;ל של מדיום + DMEM, ולהעביר לצלחת 100 מ&quot;מ מצופה ג&#39;לטין. דגירה התאים 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 באינקובטור עד שהם ומחוברות 80-90%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המעבר של 293 תאים: תאים לשטוף עם PBS, לשאוב PBS, ולהוסיף 4 מ&quot;ל לכל צלחת 10 ס&quot;מ של 0.05% trypsin/0.53 mM EDTA, ו דגירה דקות 1 ב 37 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ניתוק תאים מנות ידי הקשה, resuspend עם 10 מ&quot;ל DMEM + בינוני להעביר צינור 15 מ&quot;ל. צנטריפוגה ב 180g במשך 5 דקות, ואת לשאוב supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת נפח מתאים של DMEM + בינוני לשבור את התאים לתוך ההשעיה תא בודד על ידי pipetting מעלה ומטה מספר פעמים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספירת התאים ולהתאים את הריכוז 5 תאים לכל 8x10 מ&quot;ל עם מדיום FP. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זרעים תאים ב 6 תאים 8x10 (10 מ&quot;ל) לכל צלחת 100 מ&quot;מ תרבות, דגירה לילה ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2. </li></ol> שלב 2: Transfect 293 תאים עם פלסמידים lentivirus וירוס קציר <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור צלחת 10 ס&quot;מ כל אחת, להשתמש 10 מיקרוגרם של FUW-tetO-cDNA (Oct4, Sox2, Klf4 או c-myc) עמוד השדרה lentivirus עם 2.5ug של PMD-G ו - 7.5 מיקרוגרם של pPax2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעוד aliquoting שלושה פלסמידים לתוך צינור, לספק 30μl של מגיב 6 transfection Fugene לתוך צינור שנייה המכיל 500μl של DMEM ללא נסיוב ומערבבים בעדינות אצבע על ידי הקשה ואת דגירה של 5 דקות בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוסיפים את תערובת ה-DNA טיפה אחר טיפה לתוך הצינור Fugene 6/DMEM-containing, לערבב בעדינות על ידי הקשה אצבע דגירה של 20 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוסיפים את ה-DNA / 6 Fugene dropwise מורכב לתוך צלחת של 293 של ו דגירה לילה בשעה 37 ° C, 5% CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למחרת בבוקר: לשאוב transfection מגיב המכילים בינוני, מוסיפים 5 מ&quot;ל של מדיום ES טרי התא, ולהחזיר את התאים אל האינקובטור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ב 48 שעות ו 72 שעות לאחר transfection, לאסוף את המדיום של 293 זה באמצעות מזרק חד פעמי של 10 מ&quot;ל סטרילי, סינון זה באמצעות 0.45-מיקרומטר גודל מסנן נקבוביות צלולוזה אצטט, והעברת לשפופרת 15 מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לרכז את supernatant וירוס על ידי ultracentrifugation. Resuspend גלולה וירוס בנפח הרצוי ולעשות amixture של חלקים שווים של המדיום המכיל Oct-3/4-, Sox2-, Klf4 ו-c-myc-lentiviruses. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אמנם עושה את הנגיף, או להכין Oct4-neo/rtTA Oct4-GFP/rtTA MEFs (מעבר &lt;3) 90% confluency ב 10 ס&quot;מ מנות (2x10 6 תאים לכל מנה) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב את המדיום תרבות לשטוף עם 10 מ&quot;ל של PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בטל PBS, להוסיף 1 מ&quot;ל לכל צלחת של 0.05% trypsin/0.53 mM EDTA, ו לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 9 מ&quot;ל של המדיום תרבות, להשעות את התאים לתא אחד, להעביר צינור 15 מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספירת תאים, ולהתאים את הריכוז 4 תאים 8x10 לכל מ&quot;ל. העברת 10 מ&quot;ל של השעיה תא (8x10 5 תאים) על צלחת בגודל 10 ס&quot;מ מצופה ג&#39;לטין. דגירה את המנה לילה בשעה 37 ° C, 5% CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב את המדיום מתוך קערה פיברובלסטים, ולהוסיף 10 מ&quot;ל של מדיום וירוס המכיל את. דגירה תאים 4 שעות עד לילה בשעה 37 ° C, 5% CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחרי 24 לשאוב את המדיום מתוך קערה פיברובלסטים, ולהוסיף 10 מ&quot;ל של מדיום ES טרי התא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החלף בינוני קבוע תא ES עם דוקסיציקלין בינוני המכיל ליזום את הביטוי של ארבעת הגנים, או במילים אחרות, ליזום תכנות מחדש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם באמצעות כתב Oct4, ניאו, אז ליזום סעיף התרופה בכל עת בין 6 ל 9 ימים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שנה את בינונית בכל יום עד המושבות להיות גדול מספיק כדי להיות נטל. מושבות צריך קודם להיות גלוי כשבוע לאחר תחילת של תכנות מחדש. הם צריכים להיות גדולים מספיק כדי להיות הרים סביב יום 20. </li></ol> שלב 3: הרמת מושבות iPS יום לפני קטיף: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Seed את המספר הדרוש של ג&#39;לטין מצופה 24 גם צלחות עם γ-מוקרן DR4 MEFs </li></ol> בחירת המשובטים על יום 1: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיד המושבות על הצלחות 1-2 שעות לפני קטיף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 15 μl של PBS על הבארות של צלחת תחתית ה-V-96-היטב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את צלחת המכילה מושבות להיות נטל פעם אחת עם PBS ולהוסיף 10ml של PBS על המנה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר את מושבות עם טיפים קטנים pipet 5μl (להגדיר את pipetman P20 על μl 4). העברת שיתוףlonies לבאר בצלחת 96-היטב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 20 μl של טריפסין זה גם שימוש מרובה ערוצים (12) pipetor. Pipet למעלה ולמטה 3 פעמים. לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 4 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 100 μl של המדיום ES למושבות trypsinized. Pipet למעלה ולמטה 10 פעמים. העברת 6 שיבוטים בכל פעם מצלחת 96-היטב צלחת 24 גם באמצעות טיפ במיקום כל האחרים pipetor 12 את המקום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגדל את התאים על צלחת 24 גם ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 באינקובטור עד שהתאים מגיעים 80-90% confluency, האכלה יומית עם המדיום הסלולרי ES. תאים כנראה יהיה מוכן להרחיב על 3-7 ימים. </li></ol> שלב 4 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרחבת תאים iPS <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב את המדיום, לשטוף את התאים עם 1 מ&quot;ל של PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר PBS לחלוטין, להוסיף 0.1 מ&quot;ל של 0.25% טריפסין / 1 mM EDTA ו לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 0.4 מ&quot;ל של המדיום ES ו להשעות את התאים על ידי pipetting מעלה ומטה כדי השעיה תא בודד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את ההשעיה התא היטב של צלחת 6-היטב, להוסיף 1.5 ES מ&quot;ל בינוני התא דגירה של 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 באינקובטור לתאים להגיע עד 80-90% confluency ב 6 גם הצלחות. בשלב זה, להכין מלאי קפוא של התאים, כדלקמן. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנת מלאי להקפיא <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב את המדיום, לשטוף את התאים של 2 מ&quot;ל PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר PBS לחלוטין, להוסיף 0.5 מ&quot;ל של 0.25% טריפסין / 1 mM EDTA ו לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 2 מ&quot;ל של המדיום ES ו להשעות את התאים על ידי pipetting מעלה ומטה כדי השעיה תא בודד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את ההשעיה לתא צינור 15 מ&quot;ל, לספור את מספר התאים ספין מטה את התאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בטל supernatant, resuspend את התאים בינוני ES לריכוז בבית 2x10 6 תאים לכל מיליליטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 2 תא הקפאה ES בינוני (DMSO 20% ES בינוני) ו aliquot אותו 0.5 מ&quot;ל לכל מבחנה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת 0.5 מ&quot;ל של ההשעיה תא להקפיא צלוחיות ומערבבים בעדינות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימו את צלוחיות במיכל תא הקפאה ולשמור אותו -80 מעלות צלזיוס למשך הלילה; להעביר חנקן נוזלי למחרת לאחסון ארוך טווח. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Takahashi, K., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+mouse+embryonic+and+adult+fibroblast+cultures+by+defined+factors.">Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors.</a> Cell. 126, 663-676 (2006).</li><li>Wernig, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=et+al+.+In+vitro+reprogramming+of+fibroblasts+into+a+pluripotent+ES-cell-like+state.">et al . In vitro reprogramming of fibroblasts into a pluripotent ES-cell-like state.</a> Nature. 448, 318-324 (2007).</li><li>Okita, K., Ichisaka, T., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+germline-competent+induced+pluripotent+stem+cells.">Generation of germline-competent induced pluripotent stem cells.</a> Nature. 448, 313-317 (2007).</li><li>Maherali, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+epigenetic+remodeling+in+directly+reprogrammed+fibroblasts.">Global epigenetic remodeling in directly reprogrammed fibroblasts.</a> Cell Stem Cell. 1, 55-70 (2007).</li><li>Brambrink, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequential+expression+of+pluripotency+markers+during+direct+reprogramming+of+somatic+cells.">Sequential expression of pluripotency markers during direct reprogramming of somatic cells.</a> Cell Stem Cell. 2, 151-159 (2008).</li></ol>

בסרטון הזה אנחנו מדגימים איך להשתמש, ועין מתנהלת מערכת lentiviral ליצור GFP חיובי, iPS תאים pluripotent מ MEFs נגזר עכברים Oct4-GFP/R26-M2rtTA ו Nanog-GFP/R26-M2rtTA. פרוצדורה זו היא שיטה יעילה להפקת תאים iPS כי זה מאפשר לשלוט על הביטוי transgene במהלך תהליך תכנות מחדש. למרות השימוש של וירוסים בדור של תאים iPS מונעת את השימוש של תאים אלה בסביבה קלינית, הליך זה מאפשר לנו לענות על כמה שאלות ביולוגיות העיקריים להדגיש את תהליך תכנות מחדש מוגדר עדיין.

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Doxycycline hyclate</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>D9891-100G</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

generating ips cells from mefs through forced expression of sox-2, oct-4, c-myc, and klf4

Pluripotency יכול להיגרם על Murine מובחן על ידי התמרה ויראלית של Oct4, Sox2, Klf4, ו c-myc (טקהאשי ו יאמאנאקה, 2006; Wernig, et al, 2007;. Okita, et al, 2007;.. Maherali, et al, 2007). אנחנו פיתחו אסטרטגיה reprogramming שבו אלה גורמי תעתוק ארבעה הביעו מן דוקסיציקלין (DOX), ועין מתנהלת וקטורים lentiviral (Brambrink et al. 2008). באמצעות אלה בונה ועין מתנהלת, אנחנו יכולים להפיק המושרה גזע pluripotent (IPS) של תאים עובריים של עכבר fibroblasts (MEFs). בסרטון הזה, אנחנו מדגימים את ההליך עבור הדור של lentiviruses ועין מתנהלת המבטאים את ארבעת גורמי תעתוק ולהראות כיצד להדביק MEFs עם וירוסים אלה כדי לייצר תאים iPS. באמצעות lentiviruses ועין מתנהלת, את הביטוי של ארבעת הגורמים מבוקרים על ידי תוספת של doxycyline עד בינוני התרבות. יתרונה של מערכת זו על הזיהום retroviral המסורתי הוא היכולת להפוך את הגנים לסירוגין כך קינטיקה של תכנות מחדש וביטוי דרישות הגן ניתן לנתח בפירוט.

Watch this Scientific Journal Video about Generating iPS Cells from MEFS through Forced Expression of Sox-2, Oct-4, c-Myc, and Klf4 at JoVE.com

Generating iPS Cells from MEFS through Forced Expression of Sox-2, Oct-4, c-Myc, and Klf4

וידאו זה מציג את התהליך להפקת המושרה בתאי גזע pluripotent באמצעות lentivirus ועין מתנהלת המבטאים Oct4, Sox2, c-myc ו Klf4.

יצירת iPS תאים MEFS דרך ביטוי מאולץ של סוקס-2, אוקטובר-4, c-myc, ו Klf4

Pluripotency can be induced in differentiated murine by viral transduction of Oct4, Sox2, Klf4, and c-Myc (Takahashi and Yamanaka, 2006;  Wernig, et al., ...

generating-ips-cells-from-mefs-through-forced-expression-sox-2-oct-4

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

36.2K Views.  Whitehead Institute for Biomedical Research, Massachusetts Institute of Technology. וידאו זה מציג את התהליך להפקת המושרה בתאי גזע pluripotent באמצעות lentivirus ועין מתנהלת המבטאים Oct4, Sox2, c-myc ו Klf4.

Video: Generating iPS Cells from MEFS through Forced Expression of Sox-2, Oct-4, c-Myc, and Klf4

From MEFs to Matrigel I: Passaging hESCs in the Presence of MEFs

This video demonstrates how to grow human embryonic stem cells (hESCs) on mouse embryonic fibroblast (MEF) feeder cells.


This video demonstrates how to grow human embryonic stem cells (hESCs) on mouse embryonic fibroblast (MEF) feeder cells. Part 1 of 3.

מ MEFs כדי Matrigel אני: hESCs Passaging בנוכחות MEFs

This video demonstrates how to grow human embryonic stem cells (hESCs) on mouse embryonic fibroblast (MEF) feeder cells.
...

From MEFs to Matrigel 2: Splitting hESCs from MEFs onto Matrigel

This video demonstrates how to grow human embryonic stem cells (hESCs) on mouse embryonic fibroblast (MEF) feeder cells, how to passage hESCs from MEF plates to feeder cell-free Matrigel plates.


This video demonstrates how to maintain the growth of human embryonic stem cells (hESCs) in feeder cell-free conditions and how to continuously passage hESCs in feeder cell-free conditions. Confirmation of hESC pluripotency grown in feeder cell-free conditions by immunofluorescence microscopy is also demonstrated. Part 2 of 3.

מ MEFs כדי Matrigel 2: hESCs פיצול מן MEFs על Matrigel

This video demonstrates how to grow human embryonic stem cells (hESCs) on mouse embryonic fibroblast (MEF) feeder cells, how to passage hESCs from MEF ...

From MEFs to Matrigel 3: Passaging hESCs from Matrigel onto Matrigel

This video demonstrates how to maintain the growth of human embryonic stem cells (hESCs) in feeder cell-free conditions and how to continuously passage hESCs in feeder cell-free conditions. Confirmation of hESC pluripotency grown in feeder cell-free conditions by immunofluorescence microscopy is also demonstrated.

This video demonstrates how to maintain the growth of human embryonic stem cells (hESCs) in feeder cell-free conditions and how to continuously passage hESCs in feeder cell-free conditions. Confirmation of hESC pluripotency grown in feeder cell-free conditions by immunofluorescence microscopy is also demonstrated. Part 3 of 3.

מ MEFs כדי Matrigel 3: hESCs Passaging מ Matrigel על Matrigel

This video demonstrates how to maintain the growth of human embryonic stem cells (hESCs) in feeder cell-free conditions and how to continuously passage ...

The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell  electroporation system and Gene Pulser  electroporation buffer were specifically developed to transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells.This video demonstrates how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow, and then prepare them for electroporation in the MXcell system. We begin by isolating femur and tibia. Bone marrow from both femur and tibia are then harvested and cultures are established. Cultured bone marrow cells are then transfected and analyzed.

This procedure describes how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow and is followed by transfection using the Gene Pulser MXCell electroporation system.

הכנת ראשי בתרביות תאים hematopoietic ממח העצם Murine עבור electroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents (Methanol, Ethanol or 2-Propanol) and acetic acid are used for fixation, staining and destaining of proteins in a gel after SDS-PAGE. To speed up the procedure, heating the staining solution in the microwave oven for a short time is frequently used. This usually results in evaporation of toxic or hazardous Methanol, Ethanol or 2-Propanol and a strong smell of acetic acid in the lab which should be avoided due to safety considerations. In a protocol originally published in two patent applications by E.M. Wondrak (US2001046709 (A1), US6319720 (B1)), an alternative composition of the staining solution is described in which no organic solvent or acid is used. The CBB is dissolved in bidistilled water (60-80mg of CBB G-250 per liter) and 35 mM HCl is added as the only other compound in the staining solution. The CBB staning of the gel is done after SDS-PAGE and thorough washing of the gel in bidistilled water. By heating the gel during the washing and staining steps, the process can be finished faster and no toxic or hazardous compunds are evaporating. The staining of proteins occurs already within 1 minute after heating the gel in staining solution and is fully developed after 15-30 min with a slightly blue background that is destained completely by prolonged washing of the stained gel in bidistilled water, without affecting the stained protein bands.

A short protocol for protein staining with Coomassie Brilliant Blue (CBB) G-250 in polyacrylamide gels is described without using organic solvents or acetic acid as in the classical staining procedures with CBB.

הכתמה של חלבונים עם ג&#39;ל Coomassie G-250 ללא חומצה אצטית ממס אורגני

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Using the Gene Pulser MXcell Electroporation System to Transfect Primary Cells with High Efficiency

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell electroporation system and Gene Pulser electroporation buffer (Bio-Rad) were specifically developed to easily transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells. We will demonstrate how to perform a simple experiment to quickly identify the best electroporation conditions. We will demonstrate how to run several samples through a range of electroporation conditions so that an experiment can be conducted at the same time as optimization is performed. We will also show how optimal conditions identified using 96-well electroporation plates can be used with standard electroporation cuvettes, facilitating the switch from electroporation plates to electroporation cuvettes while maintaining the same electroporation efficiency. In the video, we will also discuss some of the key factors that can lead to the success or failure of electroporation experiments.

This procedure shows how to use the Gene Pulser MXcell electroporation system to rapidly and easily identify the best electroporation conditions for mouse embryonic fibroblasts (MEFs) or other primary cells. Considerations for troubleshooting are also discussed in the associated video.

שימוש ג&#39;ין Pulser מערכת MXcell electroporation כדי Transfect תאים ראשוניים עם יעילות גבוהה

Using an Automated Cell Counter to Simplify Gene Expression Studies: siRNA Knockdown of IL-4 Dependent Gene Expression in Namalwa Cells

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only to study the effects of downregulating single genes, but also to interrogate signaling pathways and other complex interaction networks.  These pathway analyses require both the use of relevant cellular models and methods that cause less perturbation to the cellular physiology.  Electroporation is increasingly being used as an effective way to introduce siRNA and other nucleic acids into difficult to transfect cell lines and primary cells without altering the signaling pathway under investigation. There are multiple critical steps to a successful siRNA experiment, and there are ways to simplify the work while improving the data quality at several experimental stages.  To help you get started with your siRNA mediated gene knockdown project, we will demonstrate how to perform a pathway study complete from collecting and counting the cells prior to electroporation through post transfection real-time PCR gene expression analysis.  The following study investigates the role of the transcriptional activator STAT6 in IL-4 dependent gene expression of CCL17 in a Burkitt lymphoma cell line (Namalwa).  The techniques demonstrated are useful for a wide range of siRNA-based experiments on both adherent and suspension cells.  We will also show how to streamline cell counting with the TC10 automated cell counter, how to electroporate multiple samples simultaneously using the MXcell electroporation system, and how to simultaneously assess RNA quality and quantity with the Experion automated electrophoresis system.

This procedure describes a quick and easy workflow to introduce siRNA into difficult to transfect cell lines and follow gene expression by real-time PCR. Use of an automated cell counter, multi-well electroporation plate, and automated electrophoresis station provide quick and reliable results without the need for expensive robotic handling.

שימוש מונה תא אוטומטי כדי לפשט את הביטוי מחקרים ג&#39;ין: siRNA מציאה הביטוי IL 4-Gene תלויים תאים Namalwa

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only ...

Cryopreserving and Recovering of Human iPS Cells using Complete KnockOut Serum Replacement Feeder-Free Medium

The discovery in 2006 that human and mouse fibroblasts could be reprogrammed to generate iPS cells 1-3 with qualities remarkably similar to embryonic stem cells has created a valuable new source of pluripotent cells for drug discovery, cell therapy, and basic research.
GIBCO media and reagents have been at the forefront of pluripotent stem cell research for years. Knockout DMEM supplemented with Knockout Serum Replacement is the media of choice for embryonic stem cell growth and now iPS cell culture 3-9. This gold standard media system can now be used for feeder-free culture with the addition of Knockout SR Growth Factor Cocktail.
Traditional human ES and iPS cell culture methods require the use of mouse or human fibroblast feeder layers, or feeder-conditioned medium. These culture methods are labor-intensive, hard to scale and it is difficult to maintain hiPS cells undifferentiated due to the undefined conditions. Invitrogen has developed Knockout SR Growth Factor Cocktail to allow you to easily transition your hiPS and hES cell cultures to feeder-free while still maintaining your use of Knockout SR.

This protocol describes the detailed procedure for cryopreserving human iPS cells in KnockOut SR cryopreservation medium and recovering these cells in complete KnockOut SR Feeder Free (KSR-FF) medium or feeder-based KnockOut SR medium.

Cryopreserving ו שחזור של תאים iPS האדם באמצעות נוקאאוט השלם מזין ללא החלפת סרום בינוני

The discovery in 2006 that human and mouse fibroblasts could be reprogrammed to generate iPS cells 1-3 with qualities remarkably similar to embryonic stem ...

A Convenient and General Expression Platform for the Production of Secreted Proteins from Human Cells

Recombinant protein expression in bacteria, typically E. coli, has been the most successful strategy for milligram quantity expression of proteins. However, prokaryotic hosts are often not as appropriate for expression of human, viral or eukaryotic proteins due to toxicity of the foreign macromolecule, differences in the protein folding machinery, or due to the lack of particular co- or post-translational modifications in bacteria. Expression systems based on yeast (P. pastoris or S. cerevisiae) 1,2, baculovirus-infected insect (S. frugiperda or T. ni) cells 3, and cell-free in vitro translation systems 2,4 have been successfully used to produce mammalian proteins. Intuitively, the best match is to use a mammalian host to ensure the production of recombinant proteins that contain the proper post-translational modifications. A number of mammalian cell lines (Human Embryonic Kidney (HEK) 293, CV-1 cells in Origin carrying the SV40 larget T-antigen (COS), Chinese Hamster Ovary (CHO), and others) have been successfully utilized to overexpress milligram quantities of a number of human proteins 5-9. However, the advantages of using mammalian cells are often countered by higher costs, requirement of specialized laboratory equipment, lower protein yields, and lengthy times to develop stable expression cell lines. Increasing yield and producing proteins faster, while keeping costs low, are major factors for many academic and commercial laboratories.
Here, we describe a time- and cost-efficient, two-part procedure for the expression of secreted human proteins from adherent HEK 293T cells. This system is capable of producing microgram to milligram quantities of functional protein for structural, biophysical and biochemical studies. The first part, multiple constructs of the gene of interest are produced in parallel and transiently transfected into adherent HEK 293T cells in small scale. The detection and analysis of recombinant protein secreted into the cell culture medium is performed by western blot analysis using commercially available antibodies directed against a vector-encoded protein purification tag. Subsequently, suitable constructs for large-scale protein production are transiently transfected using polyethyleneimine (PEI) in 10-layer cell factories. Proteins secreted into litre-volumes of conditioned medium are concentrated into manageable amounts using tangential flow filtration, followed by purification by anti-HA affinity chromatography. The utility of this platform is proven by its ability to express milligram quantities of cytokines, cytokine receptors, cell surface receptors, intrinsic restriction factors, and viral glycoproteins. This method was also successfully used in the structural determination of the trimeric ebolavirus glycoprotein 5,10.
In conclusion, this platform offers ease of use, speed and scalability while maximizing protein quality and functionality. Moreover, no additional equipment, other than a standard humidified CO2 incubator, is required. This procedure may be rapidly expanded to systems of greater complexity, such as co-expression of protein complexes, antigens and antibodies, production of virus-like particles for vaccines, or production of adenoviruses or lentiviruses for transduction of difficult cell lines.

In the post-human genomics era, the availability of recombinant proteins in native conformations is crucial to structural, functional and therapeutic research and development. Here, we describe a test- and large-scale protein expression system in human embryonic kidney 293T cells that can be used to produce a variety of recombinant proteins.

פלטפורמת ביטוי נוח כללי לייצור חלבונים המופרשים מ תאים אנושיים

Recombinant protein expression in bacteria, typically E. coli, has been the most successful strategy for milligram quantity expression of proteins. ...

siRNA Screening to Identify Ubiquitin and Ubiquitin-like System Regulators of Biological Pathways in Cultured Mammalian Cells

Post-translational modification of proteins with ubiquitin and ubiquitin-like molecules (UBLs) is emerging as a dynamic cellular signaling network that regulates diverse biological pathways including the hypoxia response, proteostasis, the DNA damage response and transcription.&#160; To better understand how UBLs regulate pathways relevant to human disease, we have compiled a human siRNA &#8220;ubiquitome&#8221; library consisting of 1,186 siRNA duplex pools targeting all known and predicted components of UBL system pathways. This library can be screened against a range of cell lines expressing reporters of diverse biological pathways to determine which UBL components act as positive or negative regulators of the pathway in question.&#160; Here, we describe a protocol utilizing this library to identify ubiquitome-regulators of the HIF1A-mediated cellular response to hypoxia using a transcription-based luciferase reporter.&#160; An initial assay development stage is performed to establish suitable screening parameters of the cell line before performing the screen in three stages: primary, secondary and tertiary/deconvolution screening. &#160;The use of targeted over whole genome siRNA libraries is becoming increasingly popular as it offers the advantage of reporting only on members of the pathway with which the investigators are most interested.&#160; Despite inherent limitations of siRNA screening, in particular false-positives caused by siRNA off-target effects, the identification of genuine novel regulators of the pathways in question outweigh these shortcomings, which can be overcome by performing a series of carefully undertaken control experiments.

Here, we describe a methodology to perform a targeted siRNA &#8220;ubiquitome&#8221; screen to identify novel ubiquitin and ubiquitin-like regulators of the HIF1A-mediated cellular response to hypoxia.&#160; This can be adapted to any biological pathway where a robust read out of reporter activity is available.

הקרנת siRNA לזיהוי יוביקוויטין ורגולטורים מערכת דמויות יוביקוויטין של מסלולים ביולוגיים בתאי יונקים בתרבית

Post-translational modification of proteins with ubiquitin and ubiquitin-like molecules (UBLs) is emerging as a dynamic cellular signaling network that ...