אנו עורכים מחקר בגנומיקה פונקציונלית תוך התמקדות בזיהוי ואפיון האלמנטים הפונקציונליים בתוך הגנום האנושי. העניין העיקרי שלנו הוא לחקור את החלק של הגנום שעדיין לא הוקצה היטב כדי להבין טוב יותר את התפקידים הפוטנציאליים שלהם וכיצד הם עשויים לתרום לביולוגיה ולמחלות אנושיות. לכלי הגנטיקה ההפוכה הנוכחיים יש כמה מגבלות, כגון השפעות לא ספציפיות ועלות גבוהה ביצירת ספריות מורכבות של SSIs או SGIs.
אתגר נוסף הוא ששיטה זו עשויה להתמקד רק באלמנטים גנומיים שהוקצו, ולהשאיר חלק גדול מהגנום לא נחקר. הפרוטוקול שפותח כאן מציע גישה חדשה לזיהוי אלמנטים גנומיים שלא היו ידועים בעבר, כולל אקסונים פונקציונליים חדשים הן בקידוד חלבונים והן בעיניים מקודדות ארוכות. כדי להתחיל, השתמש ב-DNA גנומי המבודד מספריית תאי מוטגנזה מבוססת lentivirus כתבנית ל-PCR ליניארי בתגובה של 50 מיקרוליטר. ולאחר מכן.
הוסף את שאר הריאגנטים הנדרשים המוצגים כאן בצינור ה-PCR. בצע 50 מחזורים של PCR ליניארי בתרמו-ציקלר רגיל בתנאי ה-PCR הנתונים. העבירו את מוצרי ה-PCR לצינור צנטריפוגה חדש ונקי של 1.5 מיליליטר.
מערבבים היטב את מוצרי ה- PCR עם 10 מיקרוליטר חרוזים מגנטיים של ביוטין-סטרפטווידין ודוגרים את התערובת למשך שעתיים בטמפרטורת החדר, מנערים ב -400 סל"ד באמבט מתכת. לאחר מכן, השתמשו במעמד מגנטי כדי לאסוף את החרוזים ולהסיר בזהירות את הסופרנטנט. שטפו את החרוזים עם 300 מיקרוליטר של מאגר כריכה או כביסה שש פעמים, והשליכו את הסופרנטנט לאחר כל שטיפה.
עבור סינתזת הגדיל השני, השעו מחדש את החרוזים בנפח תגובה של 24 מיקרוליטר המכיל מאגר שבר קלנוב, תערובת DNTP ופריימר P5N6 בצינור PCR. דגרו מראש את התערובת בחום של 15 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות במחזור תרמי PCR, ולאחר מכן הוסיפו שתי יחידות של שבר קלנוב לתערובת התגובה. דגרו את התערובות בתרמו-ציקלר PCR בתנאים הנתונים.
לאחר מכן, העבירו את מוצרי ה-PCR לצינור צנטריפוגה נקי חדש של 1.5 מיליליטר. השתמש במעמד מגנטי כדי ללכוד את החרוזים ולהשליך את הסופרנטנט. לאחר מכן, שטפו את החרוזים בעדינות עם 300 מיקרוליטר מים מזוקקים ללא DNase ו-RNase בארבע מעלות צלזיוס.
אספו את החרוזים והשליכו את הסופרנטנט. השעו מחדש את החרוזים בנפח תגובת PCR של 25 מיקרוליטר המכיל מאגר Taq, Taq DNA פולימראז, פריימר P5, תערובת DNTP ופריימר 3-LTR_Nest בצינור PCR. בצע את ה-PCR בתרמו-סייקלר עם ההגדרות המוצגות כאן.
השתמש בחמישה מיקרוליטרים של מוצרי ה-PCR כתבנית לסבב הבא של תגובת PCR עם פריימר Illumina P5 ופריימר Illumina P73-LTR. בצע את ה-PCR בתרמו-סייקלר בתנאים הנתונים. לאחר מכן, העבירו את מוצרי ה-PCR לצינור צנטריפוגה נקי של 1.5 מיליליטר.
לאחר איזון החרוזים משתיים עד שמונה מעלות צלזיוס לטמפרטורת החדר למשך 30 דקות, מערבבים היטב את החרוזים על ידי היפוך או מערבולת. פיפטה פי 1.2 מנפח החרוזים לצינור צנטריפוגה נקי של 1.5 מיליליטר. הוסף את מוצרי ה-PCR לחרוזים וערבב היטב על ידי פיפטינג למעלה ולמטה 10 פעמים.
דגרו על החרוזים כדי לאפשר ל-DNA להיקשר אליהם. לאחר מכן, הניחו את הדגימות על מעמד מגנטי והסירו את הסופרנטנט ברגע שהתמיסה נקייה. כעת, שטפו את החרוזים עם 200 מיקרוליטר של 80% אתנול.
יש לדגור בטמפרטורת החדר למשך 30 שניות ולהוציא את הסופרנטנט. יבש את החרוזים בטמפרטורת החדר כשהמכסה פתוח למשך כחמש דקות. כעת, הסר את הצינור מהמעמד המגנטי.
הוסף 22 מיקרוליטר מים מזוקקים ללא DNase ו-RNase. מערבבים היטב על ידי פיפטינג למעלה ולמטה 10 פעמים ונותנים לו לשבת בטמפרטורת החדר למשך שתי דקות. הנח את הצינור בחזרה על המעמד המגנטי עד שהתמיסה תהיה ברורה.
לאחר מכן, העבירו 21 מיקרוליטר של הסופרנטנט לצינור צנטריפוגה נקי של 1.5 מיליליטר. כדי למדוד ריכוז עם הפלואורומטר, הכינו את תמיסת העבודה על ידי ערבוב המגיב והמאגר ביחס של אחד ל-200. מערבבים 10 מיקרוליטר של אחד סטנדרטי ו -10 מיקרוליטר של שניים סטנדרטיים, כל אחד עם 190 מיקרוליטר של תמיסת עבודה, כדי להכין את תקני הבדיקה.
מערבבים בעדינות את התערובות במשך שתיים-שלוש שניות. לאחר מכן, הכינו את דגימת הבדיקה על ידי ערבוב מיקרוליטר אחד של מוצרי ה-PCR המטוהרים עם 199 מיקרוליטר של תמיסת עבודה. מערבבים בעדינות את התערובת במשך שתיים-שלוש שניות.
דגרו את תקני הבדיקה ודגימות הבדיקה למשך שתי דקות בטמפרטורת החדר, תוך שמירה עליהם מוגנים מפני אור, ולאחר מכן, הפעילו את הפלואורמטר. בחר את תוכנית בדיקת הרגישות הגבוהה של DNA דו-גדילי מהתפריט הראשי. לכיול, הכנס את התקן למכונה ולחץ על כפתור קריאת התקן כדי למדוד את התקן הראשון.
לאחר מכן, הכנס את תקן שניים ולחץ על כפתור קריאת התקן כדי למדוד את התקן השני. למדידת דגימה, לחץ על כפתור הפעל דגימות כדי לעבור לדף מדידת הדגימה. הכנס כל צינור המכיל את דגימת הבדיקה ולחץ על כפתור שפופרת הקריאה כדי לקבל את הריכוז.
במדגם באיכות נמוכה, שיא דומיננטי סביב 83 זוגות בסיסים מעיד על זיהום דימר מתאם. לעומת זאת, ספריית ה-NGS האיכותית מציגה פסגות עיקריות בין 150 ל-1,500 זוגות בסיסים, המשקפים את הפרופיל של ספרייה מוצלחת.
