המחקר שלנו מתרכז סביב שרוולי הרחבת המעיים ושרוולי הרחבת הנרתיק שלנו, ששניהם מספקים כוח מוסח שהוכח כמאריך משמעותית את תעלות המעי והנרתיק. אנו מקווים לייעל את המכשירים שלנו עם תוספת של טיפולים מבוססי חלבון כדי לעזור למזער את הדלקת המקומית והפיברוזיס בעקבות פריסת מכשירים אלה. על ידי קשירת חומרים טיפוליים אלה ישירות למכשירים שלנו, אנו יכולים לעקוף את הצורך במתן מערכתי המכוון ישירות לתחומי העניין שלנו במינון מקומי.
לוקליזציה זו תאפשר מינון תרופות נמוך יותר, הפחתת הסיכון לתופעות לוואי מערכתיות, וגם הורדת עלות הטיפולים. בעתיד, אנו רוצים לקבוע את קצב השחרור של טיפולים מבוססי חלבון אלה הקשורים למכשירים מצופים PVA שלנו, שיהיו נחוצים לקביעת מינוני תרופות לסוגים שונים של טיפולים. כדי להתחיל, הכינו את תמיסת האלכוהול הפוליוויניל או ה- PVA 5% על ידי הוספת חמישה גרם PVA ל -100 מיליליטר מים דה-יונים.
ערבבו את התערובת על פלטה חמה כדי לסייע בהתמוססות. לאחר מכן, הכינו את המיליגרם האחד למיליליטר של תמיסת פפטיד 2 או GLP-2 דמויי גלוקגון על ידי הוספת מיליגרם אחד של GLP-2 למיליליטר אחד של מים נטולי יונים. כווץ מראש את שרוולי הרחבת המעי ושרוולי הרחבת הנרתיק מעל פיפטה מזכוכית, וייצב את הקצוות עם פיפטות פלסטיק חתוכות המותקנות היטב סביב פיפטת הזכוכית והשרוולים.
צבעו את השרוולים המכווצים מראש בתמיסת 5% PVA בעזרת מברשת צבע קטנה. הניחו לשרוולים להתייבש בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות בין כל שכבה. לאחר שהשכבה החמישית יבשה, הנח את השרוולים המכווצים מראש לתוך חומר ייבוש מתחת למכסה בטיחות כימי.
הוסף שלושה מיליליטר של 25% גלוטראלדהיד ושלושה מיליליטר של 94 עד 98% חומצה גופרתית לכוסות פתוחות נפרדות במייבש כדי לאפשר תגובת אדים ולהצליב את ממברנות ה-PVA על השרוולים. לאחר קישור צולב למשך 48 שעות, הסר את השרוולים מהתא ואפשר לגלוטרלדהיד להתאדות למשך 15 דקות. פיפטה 50 מיקרוליטר של תמיסת GLP-2 על כל שרוול צולב לשימוש מאוחר יותר.
כדי ליצור את העקומה הסטנדרטית של GLP-2 קשורה ל-PVA, פיפטה 50 מיקרוליטר של 5% PVA על קרקעית 18 בארות של צלחת 24 בארות. השאר שש בארות ריקות כדי להחזיק את שרוולי הרחבת המעיים ושרוולי הרחבת הנרתיק עם שלוש בארות לכל סוג מכשיר. הניחו לשכבת ה- PVA להתייבש למשך הלילה בתנור בחום של 120 מעלות צלזיוס.
למחרת, הנח את צלחת 24 הבאר לתוך חומר ייבוש מתחת למכסה בטיחות כימי. הוסף שלושה מיליליטר של 25% גלוטראלדהיד ושלושה מיליליטר של 94 עד 98% חומצה גופרתית לכוסות פתוחות נפרדות בתוך המייבש כדי לאפשר תגובת אדים ולקשר את ממברנות ה-PVA לצלחת 24 הבארות. לאחר 48 שעות של קישור צולב, הסר את צלחת 24 הבארות מהמייבש ואפשר לגלוטרלדהיד להתאדות למשך 15 דקות.
לאחר מכן, צור שיפוע ריכוז על ידי הוספת 250, 150, 25 ואפס מיקרוליטר של מיליגרם אחד לתמיסת GLP-2 למיליליטר לבארות המסומנות בהתאמה. לאחר מכן, הנח את שרוולי הרחבת המעיים והנרתיק המצופים בתרופה לבארות שלהם. לאחר הוספת ריכוז ה-GLP-2 המתאים ושרוולי הרחבת המעיים המצופים בתרופות ושרוולי הרחבת הנרתיק לבארות, מקררים את צלחת 24 הבארות למשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס כדי לאפשר קשירת תרופות.
למחרת, הוסף שני מיליליטר של מיליגרם אחד למיליליטר אבקת חלב בתמיסת חסימת מים נטולת יונים לכל באר למשך שעה. לאחר החסימה יש לשטוף כל באר שלוש פעמים עם PBS למשך חמש דקות בכל כביסה. הכן את תמיסת הנוגדנים לארנב נגד GLP-2 על ידי הוספת 40 מיקרוליטר של נוגדן ארנב נגד GLP-2 ל-50 מיליליטר מים נטולי יונים.
לאחר מכן, הוסף שני מיליליטר מתמיסת הנוגדנים לכל באר של הצלחת. מקררים את הצלחת למשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס. למחרת, שטפו כל באר שלוש פעמים עם PBS למשך חמש דקות לכל כביסה.
הכן את תמיסת הנוגדנים המשנית נגד ארנב IgG אלקליין פוספטאז על ידי הוספת 20 מיליליטר נוגדן ל-40 מיליליטר מים נטולי יונים. הוסף שני מיליליטר מתמיסת הנוגדנים המשנית לכל באר ודגר בטמפרטורת החדר למשך שעתיים. לאחר שטיפת הבארות עם PBS, הוסיפו שני מיליליטר של מצע המיקרו באר הכחול האלקליין פוספטאז לכל באר ודגרו למשך 20 דקות.
במהלך הדגירה, עקוב אחר התגובה כאשר התמיסה משנה את צבעה מצהוב לכחול. עצור את התגובה על ידי פיפטינג של 200 מיקרוליטר מהתמיסה מכל באר לצלחת 96 באר מסומנת. קרא את צלחת 96 הבארות באמצעות קורא מיקרו-פלטות ספיגה באורך גל של 620 ננומטר.
צור את העקומה הסטנדרטית וחשב את ריכוז ה-GLP-2 על השרוולים המצופים PVA. ריכוז ה-GLP-2 של שרוולי הרחבת המעי והתקני שרוולי הרחבת הנרתיק הוא בממוצע 22.69 מיקרוגרם לסנטימטר רבוע בדומה לריכוז בבארות 50 מיקרוגרם בצלחת 24 בארות עם 23.7 מיקרוגרם לסנטימטר מרובע.
