עם העניין הגובר בטיפולים תאיים, יש צורך בשיטות חדשות להערכת הפונקציונליות של תאים אלה. פרוטוקול זה מאפשר הערכה חוץ גופית ארוכת טווח של קליטת תאים אלה בהקשר עצבי. היתרונות העיקריים של טכניקה זו היא כי כל המרכיבים באים ממוצא אנושי.
כמו כן, ניתן לעקוב בקלות אחר ההשתלה, וניתן לשנות בקלות את הסביבה מהאורגנואידים, מה שמאפשר בדיקת תרופות שונות או סוגים שונים של טיפולים. מי שתדגים את הטכניקה הזו תהיה איליאנה איבנז, דוקטורנטית מוכשרת במעבדה שלי. התחל על ידי הסרת התרחיף התא היחיד של תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים או תאי אב עצביים שמקורם ב- iPSC, או NPCs, מהקרח וצנטריפוגה אותם ב -300 גרם למשך חמש דקות ב -4 מעלות צלזיוס.
הסר את supernatant ו resuspend את גלולת התא ב 3 מיליגרם לכל מיליליטר של מטריצת קרום מרתף מסיס כדי לקבל נפח סופי של שני מיקרוליטר לכל הזרקה. מיד להחזיר את המתלה על הקרח עד לשימוש. מעבירים את המזרק המצונן מראש מהמקפיא של 20 מעלות צלזיוס לדלי קרח לשימוש נוסף.
לאחר מכן, הסר את צלחת אורגנואיד המוח מן האינקובטור ולהעביר את האורגנואיד לתוך צלחת 35 מ"מ באמצעות קצה רחב משעמם. כדי לייצב את האורגנואידים ולהקל על ההזרקה, הסר את המדיום ככל האפשר מבלי לפגוע באורגנואיד. הניחו את צלחת ה-35 מ"מ המכילה את האורגנואיד תחת מיקרוסקופ מנתח כדי להקל על ההזרקה.
ברגע שהאורגנואידים מוכנים להזרקה, השהו מחדש בעדינות את תאי ה-NPC המסומנים ב-EGFP באמצעות קצה פיפטה P20 מקורר, והעבירו שני מיקרוליטרים של תאים אלה למגלשת זכוכית סטרילית מצוננת מראש. קח מזרק אינסולין מלא מראש מן הקרח לצייר לאט את 2 מיקרוליטר של תרחיף התא עם שיפוע של המחט פונה כלפי מטה. פתח את מכסה הצלחת המכילה את האורגנואיד לפני מיקוד המיקרוסקופ עליו.
החזיקו את הצלחת ביד אחת, הניחו את שיפוע המחט למעלה. ועם היד השנייה, להזריק את התא לאט לתוך משטח אורגנואידים. לאחר הזרקת התאים, מחזירים את המכסה לצלחת ודגרים על האורגנואיד המוזרק למשך דקה עד שתיים.
לאחר מכן, הוסיפו בעדינות 500 מיקרוליטר של מדיום האורגנואיד לצלחת לפני העברת האורגנואיד לצלחת של 24 בארות עם קצה בור רחב. לדגור על האורגנואיד ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני עם שינוי בינוני מלא כל יום שני. טען אורגנואיד בקרה שאינו מוזרק או שלילי במיקרוסקופ פלואורסצנטי.
והגדירו את עוצמת ההארה בין 1 ל-2 ואת זמן החשיפה בין 80 ל-100 אלפיות השנייה למינימום אוטופלואורסצנטיות. לאחר מכן, טען את אורגנואיד הבקרה החיובי והעלה את זמן החשיפה כדי להבטיח שהתאים המסומנים גלויים. מקם מחדש את האורגנואיד עם קצה פיפטה רחב כדי למצוא את החלבון הפלואורסצנטי הירוק המשופר או אזור EGFP פלוס להזרקה.
הסר את המדיום לחלוטין מהאורגנואיד לפני טעינת האורגנואיד. ולדמיין אותו עם ההגדרות שנבחרו. לאחר השלמת ההדמיה, הוסף מיד מדיום חדש כדי למנוע מהאורגנואיד להתייבש.
לאחר חזרה על הסרת המדיום וההדמיה של כל האורגנואידים, מחזירים את האורגנואידים לדגירת תקינה ולשינויים בינוניים. חזור על ההדמיה במרווחי הזמן הרצויים. הניחו את המגלשה בצנצנת מכתימה של קופלין מלאה בטולואן למשך שתי דקות, וחזרו על שלב זה.
לאחר מכן, העבירו את מגלשת הזכוכית לצנצנת זכוכית עם מגלשת קופלין מלאה ב-100% אלכוהול אתילי למשך שתי דקות. וחזור על שלב זה לפני העברת המגלשה לצנצנת קופלין מלאה במים למשך שתי דקות. חזור על הכביסה במים.
לאחר מכן, הניחו מיכל פלסטיק באמבט המים, וודאו שהפלסטיק אינו נוגע בתחתית האמבטיה. יוצקים את חיץ הציטראט לתוך מיכל הפלסטיק ונותנים לו להגיע 95 עד 100 מעלות צלזיוס. ברגע שהמאגר מגיע לטמפרטורה הרצויה, מקם את המגלשות בתוך החיץ, וכסה באופן רופף את המיכל במכסה, תוך השארת המגלשות בתוך אמבט המים למשך 30 עד 40 דקות.
לאחר הדגירה, להסיר את מיכל פלסטיק מן אמבט המים ולתת לו להתקרר בטמפרטורת החדר במשך 20 דקות. שטפו את המגלשות שלוש פעמים במשך שתי דקות כל אחת עם PBS. הסר את PBS עם רקמת נייר מבלי לגעת בדגימה.
הכינו את חיץ החדירה ומלאו איתו צנצנת זכוכית מכתימה מגלשה. לטבול את השקופיות במאגר החדירה ולדגור במשך 10 דקות. חזור על שלוש שטיפות של PBS במשך שתי דקות כל אחת.
לאחר מכן, הכינו תערובת צביעה שתכסה כל דגימה והוסיפו 25 מיקרוליטר למגלשת האורגנואיד לפני הדגירה על המגלשה בטמפרטורת החדר למשך שעה. לאחר הדגירה, חזרו על שלוש שטיפות של PBS במשך שתי דקות כל אחת, והסירו את המלחים על ידי שטיפת המגלשה במים מזוקקים בתוך צנצנת מכתימה מזכוכית. לאחר מכן, הוסף 10 מיקרוליטר של תושבות נוזל ו- DAPI לכל דגימה לפני הדמיה של השקופית באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי.
לצנצנת הזכוכית קופלין המלאה באמצע הדרך בחיץ מרווה פי 2, מוסיפים 45 מיליליטר PBS, ומניחים את המגלשות בתוך צנצנת זו. דוגרים על הצנצנת למשך הלילה בחום של 4 מעלות. השתמש במיקרוסקופ פלואורסצנטי כדי לבדוק אם הפלואורופורים היו מרווים ביעילות לפני חזרה על הצביעה וההדמיה.
תלות ברורה במינון של פלואורסצנטיות GFP הייתה קיימת במספר תאי הקלט, עם EGFP עקבי בתוספת זיהוי טלאי תאים ב -10, 000 תאים ומעלה. האורגנואידים המוזרקים והבקרות שצולמו עבור EGFP חיובי הראו את ההתמדה של האתר המוזרק לאורך ארבעת חודשי המעקב. מדבקות תאים חיוביות נוספות של EGFP הופיעו תשעה ימים לאחר ההשתלה ונמשכו עד לנקודת הסיום של המחקר, מה שמצביע על נדידת התאים והשתלבותם באתרים החדשים שלהם.
בהגדלה גבוהה יותר, ניתן היה להבחין במורפולוגיה עצבית ברורה עם הקרנות ארוכות לתוך האורגנואיד, המאשרות את האינטגרציה של התאים המוזרקים. הצביעה הראשונית של סיבוב בודד אישרה את נוכחותם של תאי EGFP פלוס באתר ההזרקה, כולל תערובת של תאים ששמרו על מצב NPC, ואלה שהתמיינו לקראת גורל עצבי. עבור אורגנואידי הבקרה וההזרקה, נצפו מעט מאוד נסטין פלוס NPCs, עם רוב TUJ1 בתוספת נוירונים בוגרים לא בוגרים.
שני הכתמים העגולים נתנו פירוט רב יותר, וחשפו נוירונים בוגרים סביב רוב האזור החיצוני של האורגנואיד, עם אזורים של נוירונים לא בוגרים לכיוון האמצע. אסטרוציטים היו נוכחים באורגנואידים שהוזרקו ובקרה, והיו מפוזרים סביב הקצוות החיצוניים. הפרוסה שעבורה בוצעה הצביעה העגולה באורגנואיד המוזרק הראתה מושבת לוויין קטנה של EGFP בתוספת תאים מרוחקים מאתר ההזרקה שאימצו את הפנוטיפ של נוירונים בוגרים.
נראה כי חלק מהמושבות הללו נמצאות בקרבת אסטרוציטים. עם זאת, אף תא EGFP פלוס עם חפיפה מלאה לצביעת GFP לא הציע שהם היו סמוכים ולא יצרו את האסטרוציטים עצמם. כאשר אתה מזריק את האורגנואיד הוא שאתה צריך להימנע מהפעלת כוח רב מדי או לעשות את זה מהר מדי, כפי שאתה יכול להרוס את האורגנואיד לחלוטין.
לכן, לאחר מעקב אחר החיים, ניתן לשייך את האורגנואידים ולהשתמש בהם לניתוח ציטומטריית זרימה, או גישות ריצוף תא בודד. זה יאפשר לנו לדעת את המצב המולקולרי של התאים. טכניקה זו יכולה להיות שימושית ביותר לקידום הטיפול התאי למחלות נוירודגנרטיביות, גם למידול גידולי מוח או גרורות.
