Aneuploidy הוא הגורם הגנטי המוביל להפלה מוקדמת בבני אדם. רוב הטעויות בהפרדת הכרומוזומים מתרחשות במהלך מיוזה בביציות. לכן, הערכת מחסום הרכבת הציר בביציות היא קריטית להבנה מדוע הביציות מועדות לשגיאות.
כאן אנו מתארים שלוש טכניקות להערכה מקיפה של שלמות SAC בביציות עכבר על ידי בחינת שלבים קריטיים שונים בנקודת ביקורת באמצעות שילוב של הדמיה חיה ואימונופלואורסצנציה. מי שתדגים את ההליך תהיה ד"ר ססיליה בלנגיני, עמיתת מחקר מהמעבדה שלי. כדי להתחיל, להכין מיליליטר אחד של מדיה תרבותית המכילה nocodazole ו reversine עם DMSO כפקד כמתואר בכתב היד.
להבשלת ביציות והדמיה חיה יש להשתמש בצלחת 96 בארות מחוממת מראש באינקובטור. ולטעון את הראשון, השני והשלישי היטב עם 150 מיקרוליטר של DMSO שליטה, nocodazole ו nocodazole בתוספת טיפול reversine בהתאמה. תוך שמירת הצלחת באינקובטור בתנאים כמתואר בכתב היד.
כדי להתחיל בהבשלה מיוטית יש להסיר את המילרינון על ידי העברה רציפה של הביציות דרך 6 טיפות של 100 מיקרוליטר של תרבית ללא מילרינון המכילה DMSO. ומניחים אותם לתוך הבאר המתאימה של צלחת 96 באר. שימוש בפיפט המופעל ביד או בפה תוך צפייה בביציות תחת מיקרוסקופ סטריאו.
דמיינו את הביציות באמצעות מיקרוסקופ שדה בהיר המצויד בתא אינקובטור עם סביבה מבוקרת בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, 5% פחמן דו חמצני ו-80% לחות. צלם תמונות במישור האמצעי של הביציות במרווחים של 20 דקות במשך 24 שעות. לאחר כימות מספר הביציות שמפרישות גוף קוטבי על ידי זיהוי התאים שעוברים דרך ציטוקינים א-סימטריים עם תא קטן ליד הביצית ובתוך הזונה פלוצ'ידה המשותפת.
הצג את התמונות באמצעות תוכנת הדמיה. Microinject pro-phase one עצר ביציות עם 100 ננוגרם לכל מיקרוליטר של securin-gfp cRNA שהוכן בעבר. לאחר מיקרו-הזרקה, לאפשר לביציות להתאושש ולתרגם את הרנ"א באינקובטור הפחמן הדו-חמצני למשך שלוש שעות לפחות.
לאחר מכן לטעון 150 מיקרוליטר של מדיה תרבית עם או בלי חמישה מיקרומולר של nocodazole. ו 150 מיקרוליטר של מדיה תרבותית עם 0.5 מיקרומולר של reversine בשלוש בארות שונות של צלחת 96 בארות. שטפו את הביציות המוזרקות במיקרו דרך שש טיפות של תרבית ללא מילרינון והעבירו שליש מהביציות לכל טיפול.
שמרו את הצלחת באינקובטור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני ו-80% לחות עד שהביציות יחזרו למיוזה, כשלוש שעות לאחר שטיפת המילרינון. הקלט תמונות של הבשלת ביציות באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי המצויד בתא אינקובטור. השתמש בתוכנת ניתוח תמונות כדי לכמת הרס securin-gfp ולפתוח את התמונות של ערוץ GFP, החל מזמן 0.1.
בתוכנת הניתוח המועדפת, השתמש בכלי הבחירה או הצורה כדי לסמן כל ביצית וליצור אזור עניין לכל תא. השתמש באותו אזור עניין כדי לבחור אזור רקע לחיסור מאוחר יותר ולמדוד את עוצמת הפיקסלים של GFP בכל אזור עניין בכל נקודות הזמן. לבסוף לכל ערך GFP, החסר את מדידת אזור העניין ברקע.
לאחר פיצול המיוזה לשלוש קבוצות, מעבירים כל קבוצת מיוזה ל-100 טיפות מיקרוליטר של תרבית ללא מילרינון מדיה. כסו את הטיפות בשמן מינרלי והניחו אותן באינקובטור למשך שלוש, חמש ושבע שעות כדי להגיע לשלב הראשון של הפרומטאפאזה, השלב הראשון והמטא-שלב הראשון בהתאמה. בנקודות הזמן שהוקצו, תקנו את הביציות על ידי העברתן לטיפות של 500 מיקרוליטר של 2% פרפורמלדהיד במאגר PME למשך 20 דקות בטמפרטורת החדר באמצעות צלחת זכוכית של תשע בארות.
לאחר מכן להעביר את התאים לבאר נקייה המכילה טיפה 500 מיקרוליטר של פתרון חסימה. להמשך גילוי MAD2, העבירו את הביציות לבאר נקייה המכילה טיפה של 500 מיקרוליטר של תמיסת חדירה. לאחר הדגירה במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר, מעבירים את התאים לבאר חדשה של תמיסה חוסמת ודגרים במשך 10 דקות.
מעבירים את הביציות לטיפה של 30 מיקרוליטר של תמיסה חוסמת עם נוגדן אנטי MAD2 ונוגדן אנטי צנטרומר ודגרים במשך שעתיים בטמפרטורת החדר. כדי לשטוף נוגדנים ראשוניים עודפים לאחר העברת התאים ל 30 מיקרוליטר טיפה של חיץ PME בתוספת 0.5% טריטון, לדגור במשך 10 דקות בתא לחות. מעבירים את התאים לטיפת 30 מיקרוליטר של תמיסה חוסמת המכילה נוגדנים משניים כגון אנטי אנושי 633 ואנטי ארנב 568.
ולדגור במשך שעה בטמפרטורת החדר. כדי להרכיב את התאים בשקופית המיקרוסקופ, העבר את התאים לטיפה של 10 מיקרוליטר של מדיית הרכבה המכילה DAPI. הוסיפו נקודות קטנות של וזלין לכל פינה של פתק הכיסוי.
הניחו אותם בזהירות על גבי ירידת המדיה המותקנת ולחצו לאט כדי להפיץ. אטמו את החלקת הכיסוי למגלשה באמצעות לק שקוף. תמונה kinetochores באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי מצויד מטרה 40 או 63 X.
ובאמצעות אות נוגדנים אנטי צנטרומר לקבוע את טווח Z המאפשר הדמיה של כל אזור הכרומוזומים. הביציות שטופלו ב-DMSO הוציאו גוף קוטבי כ-14 שעות לאחר שחרורו מהמילרינון. לאחר הפעלת SAC, ביציות שטופלו בנוקודזול נעצרו במטא-פאזה הראשונה ולא הוציאו גוף קוטבי.
עם זאת, בהיעדר הפעלת SAC, הביציות הוציאו גוף קוטבי למרות שלא היו לו חיבורי מיקרוטובולים קינטוחורים. הוערך שיעור השפלת ה-securin-gfp במהלך ההבשלה המיוטית. כאשר הביקורת DMSO טיפל בביציות securin-gfp עוצמת מתחיל לרדת בערך 10 שעות לאחר שטיפת milrinone.
כאשר הביציות הבשילו בנוכחות סוכן מפעיל SAC, רמות nocodazole, securin-gfp היו יציבות במהלך כל תקופת ההבשלה המיוטית . לעומת זאת, בעת מניעת הפעלת SAC עם טיפול הפיך, דפוס הסקורין-GFP הואץ וההתפרקות החלה בערך ארבע שעות לאחר שטיפת המילרינון, בהתאם לעיכוב SAC. הדמיה קונפוקלית שימשה לגילוי צנטרומרים ו- MAD2 של ביציות שהבשילו לפרומטאפאזה מוקדמת אחת, פרומטאפאזה מאוחרת אחת ומטאפאזה אחת.
כדי להעריך את עוצמת אות ה-SAC, כומתה עוצמת הפיקסלים MAD2 של הקינטוחור המקומי. רמות משמעותיות של גיוס MAD2 לקינטוכורים מתרחשות בשלב הראשון של השלב הראשון, כאשר רוב הקינטוכורים לא היו מחוברים למיקרוטובולים. רמות MAD2 ירדו בפרומטאפאזות מאוחרות יותר וכמעט נעדרו בשלב הראשון כאשר כל הקינטוכורים היו מחוברים ביציבות למיקרוטובולים.
חשוב להדגיש שלכל אחת מהטכניקות הללו יש את המגבלות שלה ואת הפרשנות שלהן. ואנו מציעים לבצע שילוב של שיטות אלה כדי להעריך את שלמות SAC. שלושת המאמרים הללו מאפשרים לחוקרים להעריך את חומרת השק בביציות ולתת תובנה לגבי גורם פוטנציאלי לאנאופלואידיות בביציות אנושיות.
