תרביות אורגנוטיפיות של קליפת המוח הבוגרת האנושית הן עד כה המערכת היחידה לבדיקת טיפולים בתאי גזע עבור קליפת המוח הפגומה המאפשרת לחקור את האינטראקציה בין תאים אנושיים מושתלים לתאים מארחים אנושיים. טיפול שנבחן במודלים של בעלי חיים נכשל בדרך כלל כאשר הוא מתורגם למסגרות הקליניות בשל ההבדלים בין מכרסם לתאים אנושיים. כאן, אנו יכולים לחקור תאים מושתלים, הישרדות, התמיינות ופונקציונליות בסביבה מאדם לאדם.
מתודולוגיה זו תעזור לנו להבין כיצד המעגלים העצביים פועלים במוח האנושי, והיא גם תעודד את תרגום הידע הזה להגדרות הקליניות כדי לשפר את ההתאוששות התפקודית לאחר נזק מוחי. ידגימו את ההליך רחל מרטינז-קוריאל, דוקטורנטית, וקוסטנזה ארטיו-מדינה, סטודנטית לתואר שני, שתיהן מהמעבדה שלי. כדי להתחיל, הניחו את תוספות התרבית בצלחת בת שש בארות באמצעות מלקחיים במעבדה לתרביות תאים מתחת למכסה מנוע מאוורר.
הוסף חמישה מיליליטר של המדיום קליפת המוח הבוגר האנושי בתחתית העלון עד שהוא בא במגע עם הממברנה. הימנעו מהיווצרות בועות והוסיפו שני מיליליטר של המדיום על גבי העלון. לפני העברת פרוסות הרקמה לתוספות, יש לאזן אותן באינקובטור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ופחמן דו חמצני של 5% למשך שעתיים לפחות.
אספו את הרקמה מהמטופל בחדר הניתוח לתוך מיכל של תמיסת חיתוך קפואה, מבעבעת ומרוסקת. מעבירים מיד את המיכל הסגור על קרח לאזור החיתוך של המעבדה. בדקו את הרקמה, ובהתחשב בכיוון של שכבת קליפת המוח, אתרו את המשטח הטוב ביותר כדי להדביק אותו לשלב החיתוך של הוויברטום.
במידת הצורך, חתכו את המשטח הלא אחיד עם האזמל כדי להניח את הרקמה על הבמה לכיוון פרוסה אופטימלי. לאחר מכן, הדביקו את הרקמה לשלב עם דבק רקמות. מניחים אותו בתא החיתוך וממלאים אותו מיד בתמיסת חיתוך קרה ומבעבעת.
המשיכו את המבעבעים במהלך כל הליך החיתוך. כעת חתכו פרוסות קורונליות או קשתות בהתאם לכיוון הרקמה ללהב כמתואר בכתב היד. מניחים את הפרוסות בתא האיסוף עם תמיסת חיתוך מבעבעת בטמפרטורת החדר.
לאחר שכל הרקמה נחתכה, מעבירים את הפרוסות לצלחת פטרי סטרילית עם תמיסת שטיפה בטמפרטורת החדר כדי להסיר עודפי סוכרוז מהפרוסות ולהעבירן למעבדה לתרביות תאים. לאחר מכן, הניחו את פרוסות הרקמה בנפרד על גבי התוספות הרטובות והשקועות. לאחר 24 שעות, שנה את המדיום כדי להסיר את שאריות הסוכרוז או חומרים שיוריים אחרים מהליך החיתוך.
לאחר שבועיים, השתמש בתווך קליפת המוח האנושית הבוגרת ללא גנטמיצין. הסר את המדיה מבקבוק תרבית התא. ביום השביעי להתמיינות, יש לנתק תאי GFP-lt-NES שעברו הכנה קורטית על ידי הוספת 500 מיקרוליטר טריפסין ולדגור במשך 5 עד 10 דקות בטמפרטורת החדר.
לאחר מכן, להוסיף נפח שווה של מעכב טריפסין ואחריו חמישה מיליליטר של מדיום DDM. להשהות מחדש את התאים, להעביר בעדינות את תרחיף התא לתוך צינור 15 מיליליטר, צנטריפוגה במשך חמש דקות ב 300 גרם.בינתיים, להעביר את הצלחת המכילה את הרקמה האנושית מן האינקובטור אל מכסה המנוע, ולהסיר שני מיליליטר של מדיה מראש החדר. בסוף הצנטריפוגה, מסירים את הסופרנטנט, משעים מחדש את התאים במטריצת קרום מרתף קרה, טהורה, ומעבירים את הפנסיה לצינור קטן יותר.
אספו את מתלה התא לתוך נימי זכוכית קרים המחוברים לטיט גומי לשאיבה. הזריקו את תרחיף התא כטיפות זעירות על ידי דקירת פרוסת הרקמה החצי יבשה באתרים שונים. תנו לג'ל להתמצק ב-37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
לאחר מכן, להעביר את הצלחת מן האינקובטור בחזרה אל מכסה המנוע בזהירות להוסיף שני מיליליטר של מדיום קליפת המוח הבוגר האנושי לחלק העליון של הכנס כדי לטבול לחלוטין את הרקמה. רקמת קליפת המוח האנושית הבוגרת החריפה הראתה נוכחות של נוירונים, אוליגודנדרוציטים ואסטרוציטים המציגים שימור אופטימלי של הרקמה. הרקמה הראתה ביטוי של סמנים עצביים NeuN ו- Map2 לאחר שבועיים של תרבית תאים.
רישום מהדק טלאי התא כולו הראה שלתאי עצב היה פוטנציאל מתמשך של קרום מנוחה ועמידות לקלט הממברנה, בדומה לתאי עצב מתכשירים חריפים. התאים היו מעט פחות פעילים מאשר ברקמה טרייה, אם כי רוב התאים היו מסוגלים לירות לפחות פוטנציאל פעולה אחד, אם לא מרובים. רקמת קליפת המוח החריפה הראתה ביטוי של סמנים מיקרוגליאליים Iba1 ו- Tmem119.
לאחר שבועיים בתרבית, תאי המיקרוגליה נעשו פחות מסועפים ורכשו מורפולוגיה פעילה יותר מאשר ברקמה חריפה. ארבעה שבועות לאחר השתלת ex vivo, תאי GFP-lt-NES שהושתלו הציגו נוירוטים מורחבים עם ארבוריזציה נרחבת ומורכבת לאורך כל התרבית האורגנוטיפית. בקושי שרדו תאים מושתלים ברקמה שהשתמרה בצורה גרועה.
פסולת ותיוג לא ספציפי של נוגדנים על תאים מתים נצפו באופן נרחב בכל הפרוסה האנושית. במקרה של השתלה מוצלחת, התאים הפכו פעילים מבחינה תפקודית ותאי עצב בוגרים הראו פוטנציאלי פעולה חוזרים ונשנים ולעתים קרובות ספונטניים. נתרן מהיר פנימה, זרמי אשלגן איטיים כלפי חוץ ורמה מסוימת של פעילות סינפטית מצביעים על אינטגרציה תפקודית של השתל עם הרקמה המארחת ארבעה שבועות לאחר ההשתלה.
ככל שהרקמה האנושית מעובדת מהר יותר ברגע שהיא יוצאת מחדר הניתוח, כך כדאיות המערכת גבוהה יותר והצלחת ההליך הניסיוני גבוהה יותר.
