تعد مزارع النمط العضوي للقشرة البشرية البالغة حتى الآن النظام الوحيد لاختبار علاجات الخلايا الجذعية للقشرة التالفة التي تسمح بدراسة التفاعل بين الخلايا البشرية المطعمة والخلايا المضيفة البشرية. عادة ما يفشل العلاج الذي تم اختباره في النماذج الحيوانية عند ترجمته إلى الإعدادات السريرية بسبب الاختلافات بين القوارض والخلايا البشرية. هنا ، يمكننا دراسة الخلايا المطعمة ، والبقاء على قيد الحياة ، والتمايز ، والوظائف في بيئة من إنسان إلى إنسان.
ستساعدنا هذه المنهجية على فهم كيفية عمل الدوائر العصبية في الدماغ البشري ، كما أنها ستحفز ترجمة هذه المعرفة إلى الإعدادات السريرية لتحسين التعافي الوظيفي بعد تلف الدماغ. سيوضح الإجراء راكيل مارتينيز كورييل ، طالب دكتوراه ، وكوستانزا أريتيو ميدينا ، طالب ماجستير ، وكلاهما من مختبري. للبدء ، ضع إدخالات المزرعة في لوحة من ستة آبار باستخدام ملقط في مختبر زراعة الخلايا تحت غطاء جيد التهوية.
أضف خمسة ملليلتر من الوسط القشري البشري البالغ في الجزء السفلي من الملحق حتى يلامس الغشاء. تجنب تكوين الفقاعة وأضف ملليلتر من الوسط أعلى الإدخال. قبل نقل شرائح الأنسجة إلى الإدخالات ، قم بموازنتها في الحاضنة عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة ساعتين على الأقل.
اجمع الأنسجة من المريض في غرفة العمليات في وعاء من محلول القطع المجمد والفقاعات والمكسر. انقل الحاوية المغلقة على الثلج على الفور إلى منطقة القطع في المختبر. افحص الأنسجة ، وبالنظر إلى اتجاه الطبقة القشرية ، حدد أفضل سطح للصقه بمرحلة قطع الاهتزاز.
إذا لزم الأمر ، قم بقص السطح غير المستوي بالمشرط لوضع المنديل على المسرح للحصول على أفضل توجيه للشريحة. ثم ، الغراء الأنسجة إلى المرحلة مع لاصق الأنسجة. ضعه في حجرة التقطيع واملأه على الفور بمحلول قطع بارد وفقاعات.
استمر في الفقاعات أثناء إجراء القطع بالكامل. الآن قطع شرائح إكليلية أو سهمية اعتمادا على اتجاه الأنسجة إلى الشفرة كما هو موضح في المخطوطة. ضع الشرائح في غرفة التجميع بمحلول قطع الفقاعات في درجة حرارة الغرفة.
بمجرد قطع جميع الأنسجة ، انقل الشرائح إلى طبق بتري معقم بمحلول شطف في درجة حرارة الغرفة لإزالة السكروز الزائد من الشرائح ونقلها إلى مختبر زراعة الخلايا. بعد ذلك ، ضع شرائح الأنسجة بشكل فردي فوق الحشوات الرطبة والمغمورة. بعد 24 ساعة ، قم بتغيير الوسط لإزالة أي سكروز متبقي أو مواد متبقية أخرى من إجراء القطع.
بعد أسبوعين ، استخدم الوسط القشري البشري البالغ بدون جنتاميسين. قم بإزالة الوسائط من دورق زراعة الخلايا. في اليوم السابع من التمايز ، افصل خلايا GFP-lt-NES المجهزة قشريا عن طريق إضافة 500 ميكرولتر من التربسين واحتضانها لمدة 5 إلى 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
بعد ذلك ، أضف حجما متساويا من مثبط التربسين متبوعا بخمسة ملليلتر من وسط DDM. أعد تعليق الخلايا ، وانقل تعليق الخلية برفق إلى أنبوب سعة 15 ملليلتر ، وأجهزة الطرد المركزي لمدة خمس دقائق عند 300 جم ، وفي الوقت نفسه ، انقل اللوحة التي تحتوي على الأنسجة البشرية من الحاضنة إلى غطاء المحرك ، وقم بإزالة ملليلتر من الوسائط من أعلى الإدخال. في نهاية الطرد المركزي ، قم بإزالة المادة الطافية ، وأعد تعليق الخلايا في مصفوفة غشاء باردة ونقية وقاعدية ، ونقل المعاش إلى أنبوب أصغر.
اجمع تعليق الخلية في شعرية زجاجية باردة متصلة بحلمة مطاطية للشفط. حقن معلق الخلية كقطرات صغيرة عن طريق طعن شريحة الأنسجة شبه الجافة في مواقع مختلفة. اترك الجل يتجمد عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
بعد ذلك ، انقل اللوحة من الحاضنة مرة أخرى إلى غطاء المحرك وأضف بعناية ملليلتر من الوسط القشري البشري البالغ إلى الجزء العلوي من الملحق لغمر الأنسجة بالكامل. أظهرت الأنسجة القشرية البشرية البالغة الحادة وجود الخلايا العصبية ، oligodendrocytes ، والخلايا النجمية التي تظهر الحفاظ الأمثل على الأنسجة. أظهر النسيج تعبيرا عن العلامات العصبية NeuN و Map2 بعد أسبوعين من زراعة الخلايا.
أظهر تسجيل مشبك رقعة الخلية بالكامل أن الخلايا العصبية قد حافظت على إمكانات غشاء الراحة ومقاومة إدخال الغشاء ، مقارنة بالخلايا العصبية من المستحضرات الحادة. كانت الخلايا أقل نشاطا قليلا من الأنسجة الطازجة ، على الرغم من أن معظم الخلايا كانت قادرة على إطلاق جهد فعل واحد على الأقل إن لم يكن متعددة. أظهر النسيج القشري الحاد تعبيرا عن علامات الخلايا الدبقية الصغيرة Iba1 و Tmem119.
بعد أسبوعين في الثقافة ، أصبحت الخلايا الدبقية الصغيرة أقل تشعبا واكتسبت مورفولوجيا أكثر تنشيطا من الأنسجة الحادة. بعد أربعة أسابيع من الزرع خارج الجسم الحي ، أظهرت خلايا GFP-lt-NES المطعمة خلايا عصبية ممتدة مع تشجيرات واسعة ومعقدة في جميع أنحاء ثقافة النمط العضوي بأكملها. بالكاد نجت أي خلايا مطعمة في الأنسجة المحفوظة بشكل سيئ.
لوحظ على نطاق واسع وجود حطام ووضع علامات غير محددة على الأجسام المضادة على الخلايا الميتة في جميع أنحاء الشريحة البشرية. في حالة الزرع الناجح ، أصبحت الخلايا نشطة وظيفيا وأظهرت الخلايا العصبية الناضجة إمكانات عمل متكررة وعفوية في كثير من الأحيان. يشير الصوديوم الداخلي السريع ، وتيارات البوتاسيوم البطيئة إلى الخارج ، ومستوى معين من النشاط المشبكي إلى التكامل الوظيفي للكسب غير المشروع مع الأنسجة المضيفة بعد أربعة أسابيع من التطعيم.
كلما تمت معالجة الأنسجة البشرية بشكل أسرع بمجرد خروجها من غرفة العمليات ، زادت صلاحية النظام ونجاح الإجراء التجريبي.
