זהו פרוטוקול סטנדרטי לעיבוד ואחסון של דגימות דם עבור יישומי ביופסיה נוזלית במורד הזרם המבוססים על דנ"א חופשי במחזור. זהו הפרוטוקול הסטנדרטי הראשון שפורסם, אם כי הטכניקה נמצאת בשימוש כבר מספר שנים. קל לעקוב אחריו עם ציוד סטנדרטי הזמין ברוב המעבדות התרגומיות או המדעיות.
הפרוטוקול יכול להתבצע על ידי כל צוות המעבדה. הפרוטוקול עוזר לתקנן את האופן שבו אנו אוספים ומאחסנים דגימות, מה שבסופו של דבר ישפיע במרפאה ויפחית את השונות בין מרכזים שונים המבצעים ניתוח זהה או דומה במורד הזרם, כאשר הדיוק הוא בעל חשיבות עליונה. שיטה זו שימושית במיוחד במחקר אונקולוגי וגם ביישומים קליניים.
עם זאת, זה עשוי להיות מיושם גם במחלות אחרות שאינן סרטניות שבו ביופסיה נוזלית משמש גם. לאחר דגימת הדם כבר צנטריפוגה, לדעת כמה פלזמה או סרום להסיר יכול להיות קשה, אבל בעקבות הנחיות ספציפיות זה יעזור עם זה. שאר הפרוטוקול קל מאוד למעקב עם ניסיון מוגבל במעבדה.
מי שידגים את ההליך יהיה חורחה, טכנאי מהמעבדה שלנו. כדי להתחיל, צנטריפוגה הצינור המכיל דם טרי בטמפרטורת החדר במשך 10 דקות ב 1600 פעמים גרם, עם הפסקה מקסימלית מוחל. הסר בזהירות את הצינור מהצנטריפוגה.
השלב העליון של הסרום supernatant ייראה ברור וצהבהב. בדוק אם הדגימה מראה סימנים של המוליזה ולרשום את נוכחות המוליזה בעת הצורך. בארון בטיחות ביולוגית מדרגה II, העבירו את הסרום לצינורות איסוף כ-250 מיקרוליטר אליקוטים.
האליקוטים חייבים להיות מסומנים כהלכה. הקפיאו מיד את הסרום זקוף בקופסת האחסון במינוס 80 מעלות צלזיוס, ותעדו את זמן האחסון לדוגמה. ודא שהדגימות עובדו במסגרת הזמן הנדרשת של ארבע שעות.
צנטריפוגה של צינור EDTA בטמפרטורת החדר במשך 10 דקות ב 1600 פעמים גרם, עם הפסקה מקסימלית מוחל. לאחר צנטריפוגה, הפלזמה supernatant ייראה ברור וצהבהב. בדוק אם הדגימה מראה סימנים של המוליזה והעבר את הפלזמה לצינור צנטריפוגה של 15 מיליליטר מבלי להפריע לשכבת התאים באמצעות פיפטה סרולוגית חד פעמית.
השאירו נפח שיורי קטן של פלזמה מעל שכבת התא בערך חמישה מילימטרים. אם המוליזה הוא ציין, להשליך את המדגם לניתוח נוסף. צנטריפוגה את הפלזמה וצינור צנטריפוגה של 15 מיליליטר כדי להסיר את שאריות תאי הדם השלמים הנישאים משלב הצנטריפוגה הראשון.
הסר בזהירות את הצינור מהצנטריפוגה, לא את כדור התא בתחתית הצינור, והעבר אחד עד ארבעה מיליליטר של פלזמה לפוליפרופילן קריוגני אחד עד ארבעה מיליליטר או אפנדורף באמצעות פיפטה סרולוגית חד פעמית. נפח שיורי של פלזמה חייב להישאר בתחתית הצינור כדי למנוע זיהום הפלזמה עם תאי הדם. מיד להקפיא את הפלזמה זקופה בקופסת האחסון במינוס 80 מעלות צלזיוס, ולרשום את זמן אחסון הדגימה.
ודא שהדגימות מסומנות כהלכה ועובדו במסגרת הזמן הנדרשת של ארבע שעות. אסוף את השכבה התאית באמצעות P1000 וקצה מסונן והעבר אותה לצינור של שני מיליליטר. מיד להקפיא ולאחסן במינוס 80 מעלות צלזיוס.
דוגמה למיצוי cfDNA באיכות גבוהה שניתן להשתמש בו ליישומים במורד הזרם מוצגת כאן, בעוד שתמונה גרפית זו מייצגת דוגמה לדגימה לא מתאימה עם רמה גבוהה של זיהום גנומי. חלק הפלזמה או הסרום חייב להיות בצבע צהוב. הדבר עשוי להשתנות בהתאם לדוגמה הספציפית.
דגימות עם המוליזה יש להשליך. היזהר לא להסיר כל כדור התא בעת הסרת חלק פלזמה. פרוטוקול זה יכול לשמש גם ליישומים אחרים המבוססים על חומצות גרעין וחלבונים, כגון זיהוי של רנ"א שאינם מקודדים או חלבונים בדגימות סרום ופלזמה באמצעות טכניקות לזיהוי חיסון.
זוהי טכניקה סטנדרטית מאוד המשמשת במעבדות רבות. פרוטוקול זה מסייע לחוקרים לתקנן את האופן שבו אנו מבצעים את הניתוח שלנו מכיוון שזהו היבט מכריע, הנחוץ ליישומים קליניים עתידיים.
