מודל זה יאפשר לחוקרים בשלבים הפרה-קליניים הקריטיים לקבוע בצורה מדויקת יותר את היעילות האנטי-מיקרוביאלית של פורמולציות חדשניות, ויעניק לחוקרים שליטה רבה יותר על תכנון וניסוח תרופות. מודל זה מאפשר שחזור מהיר של תוצאות בסביבת פצע מייצגת. זה מפחית את הצורך בבעלי חיים ייעודיים, ומקל על תרגום מהיר יותר של מיקרוביאלים מקומיים לזיהומים בפצעים למרפאה.
האתגרים העיקריים הם זיהום ומיומנות. טכניקה אספטית קפדנית וסבלנות לעיבוד רקמות הם חיוניים;הסרת דש מדויקת ותכליתית נדרשת להצלחת שיטה זו. התחל עם חיטוי של מלקחיים על ידי חשיפתם לעיקור בחום יבש ב 200 מעלות צלזיוס במשך שעה אחת.
יש לעטוף את כל כלי הזכוכית בטמפרטורה של 121 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות לפני השימוש. יש לחטא את חלק המצח של המנורה על ידי שפיכת כ-100 מיליליטר של תמיסת כלור דו-חמצני של 200 PPM על אזור הדגימה. לגלח את החלק המצח באמצעות קוצץ חשמלי, ולאחר מכן לשטוף עם 200 מיליליטר של 200 PPM כלור דו חמצני פתרון.
נגבו את האזור באמצעות אתנול וגליל כחול, וכסו את אזור הדגימה בקרם להסרת שיער. לאחר 35 דקות, יש לגרד בעדינות את הקרם להסרת שיער באמצעות כלי גירוד ולהעריך את אזור הדגימה. חזור על תהליך הסרת השיער אם נותרה כמות משמעותית של שיער.
שטפו את אזור הדגימה הנקי עם 200 מיליליטר של תמיסת כלור דו-חמצני ואחריו אתנול וגליל כחול. השתמש באגרוף ביופסיה סטרילי של שמונה מילימטרים כדי לחתוך דגימת עור של שמונה מילימטרים מהאזור המוכן. לאחר מכן הסר את הדגימה באמצעות מלקחיים סטריליים ואזמל להב מספר 15, תוך הקפדה על הסרת כל השומן העורי.
מניחים את הדוגמאות בצנצנת סטרילית של 0.5 ליטר מלאה ב-PBS סטרילי. ואז להעביר אותם צינורות סטריליים 50 מיליליטר מלא 50 מיליליטר של 200 PPM כלור דו חמצני פתרון. הפוך את הצינור פעמיים והשאיר אותו לעקר במשך 30 דקות.
מעבירים את הדגימות לצינור 50 מיליליטר מלא ב-40 מיליליטר PBS סטרילי. לאחר שטיפת PBS, הניחו כל דגימת עור בבאר נפרדת של צלחת בת 24 בארות. הוסף 350 מיקרוליטר של המדיום שחומם מראש בבאר, תוך שמירה על הדגימה בממשק האוויר-נוזל.
אטמו את לוחות 24 הבארות עם אטם צלחת חדיר גז לפני הנחת הצלחת לדגירה באינקובטור רקמות לחות בטמפרטורה של 5% פחמן דו חמצני ו-37 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות. לאחר הדגירה, להסיר את מדיום התרבית ולשטוף את הדגימות ב 500 microliters של PBS סטרילי. הסר את שאריות האנטיביוטיקה מהדגימה על ידי טיפול בהן במדיה נטולת אנטיביוטיקה ב-5% פחמן דו חמצני ו-37 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות.
אם מתפתחת עכירות או זיהום פטרייתי במדיה נטולת האנטיביוטיקה, יש להשליך את הדגימה. לאחר מכן, להכין צינור 50 מיליליטר עם 10 מיליליטר של מרק סויה טריפטי סטרילי. לאחר מכן מעבירים כמה מושבות סטפילוקוקוס אאורוס מצלחת אגר טרייה של S.aureus למרק, ודוגרים את הצינור ב-37 מעלות צלזיוס ו-150 סל"ד למשך 18 שעות.
לאחר צנטריפוגה של צינורות ב 4, 000 G במשך שלוש דקות, להסיר את supernatant ו resuspend את כדור התא ב 10 מיליליטר של PBS סטרילי. חזור על שטיפת PBS פעמיים לפני התאמת האינוקולום לצפיפות אופטית של 0.6 באורכי גל של 600 ננומטר באמצעות PBS סטרילי. אשר את עומס האינוקולום על ידי ספירת צלחות ידנית.
כדי להדביק את דגימת העור, הכינו צלחת טרייה של 24 בארות עם 400 מיקרוליטרים של מדיה נטולת אנטיביוטיקה שחוממה מראש, והוסיפו את 24 תוספות הבאר באמצעות מלקחיים סטריליים. הסר את המדיה מדגימות העור. לשטוף אותם עם 500 microliters של PBS סטרילי ולהסיר את לשטוף.
השתמש מלקחיים סטריליים כדי להחזיק בעדינות את הדגימה בתחתית הבאר. השתמש בביופסיית אגרוף של ארבעה מילימטרים כדי לחדור דרך דגימת העור לעומק גס של מילימטר עד שניים וליצור דש פצע מרכזי. לאחר מכן השתמש באזמל להב מספר 15 ומלקחיים של רקמת Allis בעלת שיניים סטריליות כדי להסיר את השכבה העליונה של דש הפצע.
לאחר שכל הדגימות נפצעו, העבירו אותן ל-24 הקידוחים באמצעות מלקחיים סטריליים. מזרימים 15 מיקרוליטרים של החיידק אינוקולום לתוך מיטת הפצע לפני דגירה במשך 24 שעות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באינקובטור רקמות לחות. לתקופות דגירה ארוכות יותר, מוציאים את המדיה, מחליפים אותה במדיה טרייה כל 24 שעות, ודוגרים את הצלחות באותם תנאים.
כדי לקבוע את עומס החיידקים, הסר את המדיה מתחתית הבארות. ובאמצעות מלקחיים סטריליים, מעבירים כל דגימה לצינור נפרד של 50 מיליליטר מלא במיליליטר אחד של PBS סטרילי. לאחר מכן לנתק את החיידקים מפני השטח של מיטת הפצע על ידי הומוגניזציה של משטח הדגימה עם הומוגנייזר בעל קצה דק.
ודא כי המיטה הפצע הוא במגע ישיר עם קצה של homogenizer. לאחר עיבוד כל הדגימות, מערבלים כל דגימה לפני העברת 20 מיקרוליטרים של הומוגנט לתוך הבאר המתאימה של צלחת 96 באר המכילה 180 מיקרוליטרים של PBS סטרילי. יש לדלל באופן סדרתי כל דגימה הומוגנית ל-1 כפול 10 ל-7 השלילי, ופיפטה 10 מיקרוליטרים של ההומוג'נט המדולל על צלחת אגר סויה טריפטית במשולש.
דגירה של צלחת אגר סויה טריפטית ב 37 מעלות צלזיוס, ולאחר 18 שעות, לספור את מספר המושבות כדי לקבוע את המושבות יוצרות יחידות או CFU עבור כל דגימה. משטר עיקור עור מתאים זוהה באמצעות טיפולים שונים לפרקי זמן משתנים. שלמות הרקמות נוטרה על ידי היסטולוגיה, ולאחר מכן הכתמה עם המטוקסילין ואוזין מיד לאחר הטיפול.
טיפול של 30 דקות בכלור דו-חמצני היה הטיפול היעיל ביותר, עם עיקור מחדש של רקמת העור תוך שמירה על שלמות הרקמה. סרט לבן במיטת הפצע ניכר על הרקמה 48 שעות לאחר ההדבקה. למרות שמודל השריטה הכיל מספר ממוצע גבוה יותר של יחידות יוצרות מושבה לאחר 24 שעות, טכניקת הסרת הדש הניבה תוצאות עקביות יותר.
לאחר 48 שעות, בערך פי 100 יותר יחידות CFU חיידקיות התאוששו מהרקמה הפצועה בהשוואה לאינוקולום, מה שמעיד על זיהום מוצלח. קטעי היסטולוגיה מוכתמים בגרם של הרקמה הנגועה הצביעו על נוכחותם של תאי S.aureus במיטת הפצע, אשר נעדרה בקטעים של רקמה לא נגועה. לאחר הליך זה, ניתן לבצע אימונוהיסטוכימיה כדי לחקור את תגובת הרקמות, כתם גרם שונה כדי לדמיין את לוקליזציה של החיידקים, וספירת צלחות קיימא לאחר חשיפה מיקרוביאלית לבדיקת יעילות מיקרוביאלית.
עבור החוקרים המפתחים תרופות אנטי-מיקרוביאליות חדשניות, מודל זה יספק שליטה רבה יותר על אופטימיזציה של עופרת, יפחית את ההסתמכות על ניסויים יקרים ומפוקחים היטב בבעלי חיים, ויאפשר תרגום מהיר של חומרים אנטי-מיקרוביאליים למרפאה.
