פרוטוקול זה מתאר ברצף את השלבים המעורבים באינדוקציה של דלקת פני השטח של העין ואת אוסף האיברים המושפעים הקשורים המעורבים בתפקוד לקוי של בלוטת Meibomian. מודל חדש זה של MGD מאפשר לחקור את ההיבט החיסוני המולד של המחלה, במיוחד היווצרות מלכודות נויטרופיליות חוץ-תאיות החוסמות את בלוטת המייבומיאן. ניתן להרחיב את הטכניקה המוצגת בפרוטוקול כדי להציג התערבויות טיפוליות אקטואליות בשלב פרה-קליני.
יתר על כן, אוסף של exudates עיניים ואיברים משקפים את היעילות של הטיפול. כדי לבצע הזרקה תוך-צפקית של תמיסת האימונוגן, החזיקו את העכברית C57 שחורה בת שבעה עד תשעה שבועות ללא הרדמה ברכות ליד הזנב בזמן שאתם אוחזים ברשת הכלובים. לאחר מכן החזק בחוזקה את עור הגב והצוואר באזור בין האגודל לאצבע המורה וקבע את הזנב והגפיים התחתונות בין הטבעת לאצבע הקטנה כנגד כף היד.
שמירה על העכבר קבוע עם הראש כלפי מטה, להזריק 100 microliters של פתרון אימונוגן מוכן ברביע הימני או השמאלי של חלל הבטן התחתונה. כדי לבצע אתגר משטח עיניים לאחר החיסון, יש למרוח חמישה מיקרוליטרים של ovalbumin או ביציות או מלח לכל עין של עכבר מורדם, ולהמתין חמש דקות כדי לקבל את הטיפה נספגת על ידי העין. לאחר מכן, לאסוף את exudates העין על ידי החלת 50 microliters של מלח סטרילי על העין מיד לאחר האתגר.
עבור כריתה של רקמות פני השטח של העין, מניחים את העכבר על משטח אחיד ומחטאים את האזור המסלולי סביב העין עם ספוגית 70% אתנול. כדי ליצור חתך סביב העין, בצע חתך בין האוזן לסינוס הרטרואורביטלי ולאורך המשטח מעל עצם הקשקש אנכית, תוך הרחבת החתך אופקית מתחת לעפעף התחתון לאורך העצם המקסילרית ומעל העפעף העליון לאורך העצם הקדמית. החזיקו בזהירות את הרקמה המנותקת סביב העין באמצעות מלקחיים מעוקלים, ומשכו את הרקמה ואת גלגל העין החוצה.
מניחים את האיברים שנכרתו ב- PBS סטרילי. לאחר מכן, באמצעות אזמל מתחת למיקרוסקופ הסטריאו, חתכו את רקמת שריר הפנים העודפת סביב העפעפיים העליונים שנכרתו. כדי לאסוף את הלחמית מניחים את העפעף העליון על צלחת פטרי יבשה.
לאחר מכן, באמצעות פינצטה עדינה ואזמל מקלפים את שכבת הריר הלבנבן בעדינות מתוך המשטח הפנימי של העפעף. ליד לנתח את הקרנית, הניחו את כדור העין על צלחת פטרי יבשה חדשה על גבי קרח יבש. לאחר שלוש דקות, מניחים את המנה על משטח הספסל במצב יציב.
השתמש במספריים עדינים וחדים כדי לבצע חתך קטן בגבול הקרנית ליד הלימבוס. ממשיכים את החתך עם האזמל סביב כדור הארץ, מפרידים את הסקלרה מהקרנית. לאחר מכן הסירו את שאריות הקשתית והעדשה מהישבן של הקרנית על ידי שטיפה נדיבה בתמיסת מלח.
כדי להעריך את בלוטת Meibomian ואת הפתחים שלה, מקם את העפעפיים הכרותים במצב זקוף מתחת למיקרוסקופ הסטריאו. לאחר מכן בהתאם לזמן החשיפה של המצלמה והגדרות ISO, צלם תמונות תחת אור לבן epi-illumination. כדי להעריך את אזור בלוטת Meibomian, מקם את העפעפיים הכרותים במצב אופקי והדליק את התאורה האחורית של מיקרוסקופ הסטריאו המצויד במצלמת אינפרא אדום.
צלם תמונות על ידי התאמת זמן החשיפה בהתאם ל- ISO של המצלמה. עכברים שטופלו במי מלח הראו משטחי עיניים בריאים עם עיניים פקוחות לרווחה. לשם השוואה, מריחת ביציות גורמת לדלקת חמורה במשטח העין, לפתיחה צרה של העיניים ולסימני כימוזיס.
העפעפיים שנכרתו הראו חסימות גדולות שסתמו את פתחי הבלוטה והבצקת של Meibomian, בניגוד לעפעפיים הבריאים שהראו תקעים קטנים של הבלוטה המרפדת את העפעף. בדיקה נוספת של הטרנסילומינציה האינפרא אדומה של הבלוטה מגלה את המראה הגזעי של האצ'יני של בלוטת המייבומיאן. העפעפיים של עכברים מאותגרים מלוחים הראו את האצ'יני העגול.
לשם השוואה, יישומי ביציות גרמו להרס ואובדן של בלוטות מסוימות עם מחלת העיניים האלרגית או AED. הניתוח ההיסטולוגי של העפעפיים הציג בלוטות Meibomian מורחבות בהשוואה לעכברים שניתנו עם מלוחים בלבד. הדגירה של גלגל העין על קרח יבש אפשרה חתך בקרנית ליד הלימבוס והפרדה של הקרנית מהסקלרה.
מחקר זה הקל על איסוף הקרנית. בנוסף, ניהול ביציות גרם דלקת חמורה הלחמית עם מראה hyperemic. רמות גבוהות של הכימוקין CXCL-1 מאפשרות אקסטרווזיה של נויטרופילים, פאגוציטוזה ודה-גרנולציה, ואינטרלוקין-6 המתווך את תגובת הפאזה החריפה וחדירת נויטרופילים נצפו בסופרנאטנטים של עכברי AED.
מצד שני, ריכוז האינטרלוקין-10 לא הראה שינויים משמעותיים הן בעכברים תמימים והן בעכברי AED. מודל חדש זה מאפשר פיתוח והערכה של יעילות של תרופות המכוונות למסלולים החיסוניים המולדים, והוא מסייע רבות בכריית נתונים בדרך של מתן חומרים אנטי דלקתיים. לאחר איסוף מתאים של איברים, שיטות מולטיפלקס מאוד כמו ריצוף תאים בודדים והדמיה ציטומטריה המונית תואמות לפרוטוקול זה.
