פרוטוקול זה נועד לוודא אם תרכובת אנטי HBV מועמדת מעכבת כניסה ויראלית במיוחד על ידי חסימת קשירת NTCP. טכניקה זו נועדה לחקור אם כניסת HBV או שלב ראשוני של זיהום יכול להיות מופרע על ידי כל תרכובת מועמדת. מי שידגים את ההליך יהיה פיאנוט תונגסרי, סטודנט PSP מהמעבדה שלי.
כדי להתחיל את המדידה של נתרן taurocholate co-הובלה פוליפפטיד, או NTCP, לדגור את hepatocytes בוגר עם שמונה טחנת או יותר חומצה אתילנדיאמינטטראצטית או EDTA במשך 15 דקות. לאסוף כדורי תאים ולתקן את hepatocytes על ידי הוספת 300 microliters של 3.7% paraformaldehyde ב PBS במשך 15 דקות. לאחר מכן העבירו את תרחיף התא לצינור מיקרוצנטריפוגה של 1.5 מיליליטר כדי לצנטריפוגה שלהם ב-300 G וב-25 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
שטפו את התאים פעמיים באמצעות 700 מיקרוליטרים של PBS המכילים 1% סרום בקר עוברי או FBS בצנטריפוגה למשך 10 דקות כפי שתואר קודם. לאחר מכן חלחלו לתאים עם 300 מיקרוליטרים של 0.05% טריטון X 100 ב- PBS בטמפרטורת החדר למשך 20 דקות. לאחר הצנטריפוגה לתת שלוש שטיפות של דקה אחת כל אחד באמצעות 700 microliters של PBS המכיל 1% FBS.
דגירה של התאים במשך 30 דקות בארבע מעלות צלזיוס עם הנוגדן העיקרי נגד NTCP ביחס של אחד ל-100, ולאחר מכן שלוש שטיפות עם חיץ שטיפת פרם, וצנטריפוגה. הכתימו את התאים בנוגדן משני המצומד ל-Alexa Fluor 488 למשך 30 דקות בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס וחזרו על שלוש שטיפות של חיץ שטיפת פרם במשך דקה אחת כל אחת. לאחר צנטריפוגה ב-300 גרם, יש להשעות את כדור התא עם 200 מיקרוליטרים של PBS המכילים 1%FBS.
בתוכנה, בחר את פרמטרי המדידה לניתוח ציטומטרי של זרימה, כולל FSC, SSC, FITC או PE. הגדר התאמת פיצוי אוטומטי וכלול את בקרות הפיצוי כפי שהוסבר בכתב היד. לאחר מכן, הפעל את הדגימה הלא מוכתמת בקצב זרימה נוזלית בינונית של 60 מיקרוליטר לדקה. התאם את סף הפיזור הקדמי ואת סף הפיזור הצדדי עד שהם יכסו את אוכלוסיית התאים המעניינת.
סמן את אזור השער באזור זה והחל על כל בקרות הפיצוי. הגדר את צינור מכפיל התמונה או את פלואורסצנטיית PMT באמצעות הבקרה הלא מוכתמת והתאם את מתח ה- PMT של FITC או PE ברביע השלילי. הפעל את הדגימה המוכתמת החיובית והתאם את FITC או PE בסולם הרביע החיובי.
הפעל את הפקדים הלא מוכתמים, המוכתמים ב- FITC או PE, חשב את הפיצוי והחל אותו על הגדרות הדגימה. לאחר מכן, הפעל את דגימת הפטוציטים כדי למדוד את רמת NTCP. לאחר מכן, התחל לנתח את ההפטוציטים המוכתמים על ידי בחירה סדרתית בחלונות BD FACSuite, צינור הבקרה ולאחר מכן הכרטיסייה מקורות נתונים.
המתן עד שהנתונים הגולמיים יופיעו. לאחר מכן, בכרטיסיית גליון העבודה בצד ימין לחץ על לחצן שער האליפסה, בחר את אוכלוסיית התאים ואת SSC ואת תרשים הנקודה FSC באמצעות סמן העכבר. לאחר מכן המתן עד שהעיגול P1 יופיע.
לחץ על כפתור שער המרווח וסמן את האזור בהיסטוגרמה המוכתמת באיזותיוציאנט פלואורסצין. החל מערך עוצמת הפלואורסצנציה הגבוה ביותר לצד ימין. הקו P2 מופיע על המסך.
לחץ על צינור הניסוי וראה שהנתונים בכרטיסיית גליון העבודה משתנים. לחץ על כפתור הסטטיסטיקה ולאחר מכן על החלל הריק ועל גליון העבודה. לאחר מכן, שימו לב לערכים הסטטיסטיים של אוכלוסיית הפוליפפטידים של נתרן טאורוחולאט.
שאפו את המדיום מלוחות הבאר של MHC המכילים 100% והוסיפו ארבעה מיקרומולרים ציקלוספורין A מדולל עם E Medium של ויליאם במשך שעתיים. לאחר מכן, שאף את מעכב הכניסה לנגיף הפטיטיס B המועמד כדי להחליף אותו במיליליטר אחד של וויליאמס E בינוני המכיל 4% פוליאתילן גליקול. לאחר מכן, לדגום את מדיום התרבית עם חלקיקי נגיף הפטיטיס B בריבוי של זיהום של 100 לכל באר במשך 18 שעות ב 37 מעלות צלזיוס.
לאחר מכן, השליכו את הסופר-נטנט בשני מיליליטר של PBS קר והסתחררו בעדינות כדי לשטוף את המדיום הישן עם נגיף הפטיטיס B לא מאוגד. לאחר גידול התאים עם שני מיליליטר של וויליאם E Medium שלם במשך שבעה ימים לשטוף את התאים עם PBS ולתקן אותם עם 3.7% paraform אלדהיד ו- PBS במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. לדגור ברצף על התאים הנגועים בתמיסת חסימת IF למשך 60 דקות בטמפרטורת החדר בנוגדן הראשוני בדילול של אחד עד 200 בתמיסת החסימה למשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס.
לאחר מכן יש לתת שלוש שטיפות של דקה כל אחת באמצעות תמיסת כביסה לפני הדגירה של התאים עם הנוגדן המשני בדילול אחד עד 500 למשך שעה בטמפרטורת החדר. לאחר שטיפה שלוש פעמים, הרכב את הדגימה עם מדיום הרכבה נגד דהייה עם DAPI וכסה אותה עם כיסוי זכוכית. באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי המצויד במסנני DAPI ו-PE מזהים את אות הפלואורסצנציה באמצעות עדשה אובייקטיבית של 20 x כדי לקבוע את פעילות הכניסה נגד HBV של התרכובות המועמדות.
לבדיקת קשירת התא, הכינו את התאים כפי שהודגם קודם לכן ודגרו אותם עם חלקיקי נגיף הפטיטיס B בארבע מעלות צלזיוס למשך שעתיים. לאחר השלכת המדיום, לשטוף את התאים עם שני מיליליטר של PBS קר עם מערבולת עדינה. לאחר מכן קצרו את התאים הנגועים באמצעות מגרד תאים ושיבשו את התאים עם חיץ תזה.
העבר את התא ליזאט לצינור איסוף כדי לחלץ את הדנ"א הכולל עם תגובת שרשרת פולימראז באמצעות תנאי הטמפרטורה המתוארים בכתב היד. לאחר הכנת התאים כפי שהוכח קודם, לדגור את hepatocytes עם תמיסת חומצה טאורוחולית נתרן במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר, לשאוף את הפתרון ולשטוף את התאים שלוש פעמים עם HEPES קר. לאחר מכן, הוסף 300 עד 500 מיקרוליטרים של HEPES קר כדי לקצור את התאים עם מגרדי תאים על קרח.
הומוגניזציה של התאים על ידי אולטרה סאונד ב 20 קילוהרץ במשך 20 שניות, ודגירה על קרח במשך חמש דקות. לאחר צנטריפוגה ב 10, 000 גרם, לאסוף את supernatant ולהעריך ריכוז חומצה טאורוכולית תוך תאית באמצעות חומצה טאורוכולית ELISA ערכת בדיקה. כדי לשטוף את התאים ואת המזרק בקלורימטריה של טיטרציה איזותרמית או במכשיר ITC, הפעל את תוכנת ITC.
תחת הכרטיסייה הדגשת ניסוי הפעלה, בחר שיטת micro cal עבור 19 נקודות הזרקה ITCM ולחץ על פתח. כאשר נפתח חלון חדש, לחץ על לשונית הניקוי ובחלון שיטת הניקוי בחר בלחצן הכביסה לשיטת ניקוי התא ובכפתור השטיפה לשיטת ניקוי המזרק. לחצו על הבא ופעלו לפי ההוראות שעל המסך.
לאחר טעינת הדגימה ל- ITC, לחץ על כפתור הטעינה הקיים תחת לשונית ניסוי ההפעלה. לאחר מכן לחץ על הבא ופעל לפי הוראות הווידאו עד להשלמת שלב טעינה זה. באמצעות מזרק, מלא את תא הייחוס במאגר התמיסה בתא הדגימה עם 15 מיקרומולר NTCP במאגר.
הסר את התמיסה העודפת, ולאחר מכן מלא את המזרק עם 150 Micromolar כורכומין ליגנד, הימנעות בועות אוויר. הפעל את הדוגמה על ידי לחיצה על לחצן ההפעלה תחת לשונית ניסוי הפעלה. המידע וההגדרות הניסיוניים יוצגו בצד שמאל.
הזן את ריכוזי חלבון הליגנד ואת פרטי הטמפרטורה. לחץ על התחל כדי לבצע את תהליך ההזרקה. המתן 1.4 שעות עד שהאינטראקציה עם ליגנד החלבון תושלם.
לאחר השלמת ההזרקה בחר בלחצן הניתוח המודגש כדי לנתח את הנתונים הגולמיים באמצעות תוכנת הניתוח. לאחר מכן, לחץ על סקירה כללית כדי להציג את הנתונים הגולמיים ובחר את הדגם המתאים כסט אחד של אתר כריכה. תכונות הבשלה בכבד נצפו כולל תאים דו-צדדיים ומורפולוגיה בצורת מצולע, במיוחד בשלב ההתמיינות של MHC.
עלייה גדולה בביטוי NTCP נצפתה ב- HepaRG מובחן וב- MHC מובחן. הצורה הגליקוזילית מאוד של NTCP זוהתה יותר ב-MHC מובחן מאשר ב-HepaRG מובחן. רמות ה-NTCP היו גבוהות יותר בתאי MHC ממוינים מאשר בתאים הלא מובחנים.
הכתמה אימונופלואורסצנטית של הנגיף העריכה את פעילויות הכניסה נגד HBV ביום השביעי שלאחר ההדבקה, ורמת קשירת הנגיף על קולטן פני התא הוערכה על ידי תגובת שרשרת פולימראז בזמן אמת. ניתוח ספיגת חומצה טאורוכולית העלה כי הפעילות המעכבת העונשית של תרכובות מועמדות הפחיתה את נגיף הפטיטיס B המחייב באמצעות NTCP. השינוי הצבעוני זוהה בהזרקות מתמשכות לתא הדגימה.
רגרסיה סטנדרטית של ריבועים לא ליניאריים לפחות שורטטה על סמך אתר כריכה אחד שהותאם היטב לנתונים. הקו המוצק הצביע על ההתאמה הטובה ביותר לערכי הניסוי עבור קשירת SBB כ-a וכי תאים וחלקיק נגיפי הפטיטיס B דוגרים בארבע מעלות צלזיוס. ניתן להעריך עדכון חומצה טאורוכולית באמצעות הטכניקה הרדיואקטיבית.
ניתן לכמת את רמת החומצה הטאורוכולית הרדיואקטיבית באמצעות מונה סימולציה נוזלי. טכניקה זו פשוטה ומהירה לסינון כניסה נגיפית לפעילות חקירה של כל משטר אנטי-ויראלי שיסייע במניעת הדבקה או הדבקה חוזרת.
