ביסוס אורגנואידים של ריאות אנושיות והתמיינות פרוקסימלית ליצירת אורגנואידים בוגרים של דרכי הנשימה

אנו מציגים שיטה לביסוס תרבית האורגנואידים של אפיתל דרכי הנשימה האנושיות בלוחות תרבית. אנו מפיקים אורגנואיד ריאה אנושי ישירות מרקמות ריאה ראשוניות ביעילות גבוהה. האורגנואידים של הריאה האנושית הנגזרת מורחבים ביציבות במשך למעלה משנה, ופרוטוקול התמיינות פרוקסימלית מאפשר יצירת אורגנואידים בוגרים של דרכי הנשימה שיכולים לדמות בנאמנות את אפיתל דרכי הנשימה האנושיות לרמה כמעט פיזיולוגית.

לכן, מערכת התרביות מאפשרת למדענים לשחזר ולהרחיב את אפיתל דרכי הנשימה האנושיות בלוחות תרבית. המדגימים את ההליך יהיו מאן צ'ון צ'יו ויפי יו, דוקטורנטים במעבדה שלנו כדי להתחיל את בידוד התאים מרקמות הריאה האנושיות לתרבית אורגנואידית תלת-ממדית, לטחון את רקמות הריאה לחתיכות קטנות של מילימטר אחד עם אזמל סטרילי ולשטוף את חלקי הרקמה עם 10 מיליליטרים של מדיום בסיסי קר. צנטריפוגה של הרקמות ב-400 פעמים G במשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס והשליכו את הסופרנטנט לפני החייאה של הכדור בשמונה מיליליטרים של תווך בסיסי בתוספת קולגן בריכוז סופי של שני מיליגרם למיליליטר.

לאחר מכן, לעכל את חלקי הרקמה על ידי ניעור הצינור ב 120 סל"ד במשך 30 עד 40 דקות ב 37 מעלות צלזיוס. לאחר העיכול, פיפטה למעלה ולמטה 20 פעמים באמצעות פיפטה סרולוגית של 10 מיליליטר כדי לגזוז את חלקי הרקמה המעוכלים. לאחר מכן, סנן את ההשעיה עם מסננת של 100 מיקרון לתוך צינור 50 מיליליטר.

משחזרים ומעבירים את חלקי הרקמה מהמסננת לצינור צנטריפוגה של 15 מיליליטר עם המדיום הבסיסי. כדי לסיים את העיכול, הוסיפו סרום בקר עוברי לזרימה-דרך לריכוז סופי של 2%לאחר מכן, צנטריפוגה של הצינור והחזירו את גלולת התא ב-10 מיליליטרים של התווך הבסיסי כפי שתואר קודם לכן. לאחר צנטריפוגה, החיזרו את הכדור ב-80 עד 160 מיקרוליטרים של מדיום מטריצת מרתף קר והניחו את הצינורות על קרח.

לאחר מכן, הוציאו 40 מיקרוליטרים של המתלים לכל באר של לוחית תרחיף 24 בארות שחוממה מראש. הדגירה של הצלחת ב-37 מעלות צלזיוס למשך 10 עד 15 דקות. אפשרו למטריצת המרתף להתמצק וליצור טיפה.

לאחר הדגירה, הוסיפו 500 מיקרוליטרים של אורגנואידים של אורגנואידים של ריאה אנושית עם תוספת של חמישה ננומולרים של הרגלולין-בטא 1 לכל באר ודגמו את הצלחת בחממת תרביות תאים. לאחר שלושה ימים, יש להסיר את המדיום הישן תוך שמירה על שלמות הטיפות ולהוסיף בזהירות מדיום רענן. לאחר 10 עד 14 ימים של מעבר, התבוננו באורגנואידים תחת מיקרוסקופ וודאו שהאורגנואידים אינם משובצים בצפיפות תאים גבוהה מאוד.

כדי להעביר את האורגנואידים של הריאה עם גזירה, לשבור את הטיפות על ידי צנרת למעלה ולמטה עם קצה מיליליטר אחד. לאחר מכן, העבירו את האורגנואידים יחד עם המדיום לצינור צנטריפוגה של 15 מיליליטר והתאימו את הנפח ל-10 מיליליטרים עם תווך בסיסי קר. צנטריפוגה של הצינור ב 300 פעמים G במשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס, להשליך את supernatant, ולשטוף את האורגנואידים עם 10 מיליליטרים של תווך בסיסי קר.

לאחר מכן, החיזרו את האורגנואידים בשני מיליליטרים של תווך בסיסי קר וגזרמו לחתיכות קטנות עם פיפטה של פסטר. לאחר מכן, הוסיפו את המדיום הבסיסי לנפח כולל של 10 מיליליטר וצנטריפוגה לפני שתחזירו את השברים האורגנואידים עם מטריצת מרתף קרה המספיקה כדי לאפשר הרחבה של 1:3 עד 1:5 ולהניח את הצינורות על קרח. מחלקים 40 מיקרוליטרים של תרחיף אורגנואידי בכל באר של צלחת 24 קידוח שחוממה מראש כדי לדגור ב-37 מעלות צלזיוס כדי לאפשר למטריצת המרתף להתמצק למשך 10 עד 15 דקות.

מאוחר יותר, הוסיפו 500 מיקרוליטרים של מדיום הרחבת אורגנואידים של ריאה לכל באר ודגרו בחממת תרביות תאים. לרענן את המדיום כל שלושה ימים ולהעביר את האורגנואידים כל שבועיים. כדי להעביר אורגנואידים ריאה עם טריפסיניזציה, resuspend קטפו אורגנואידים ריאה במיליליטר אחד של אנזים דיסוציאציה.

דגירה של האורגנואיד באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס למשך שלוש עד חמש דקות. לאחר מכן, מוסיפים מיליליטר אחד של מדיום בסיסי לצינור וגוזזים את האורגנואידים באופן מכני על ידי צנרת למעלה ולמטה. בדוק את גודל החלקים האורגנואידים תחת מיקרוסקופ בהגדלה של פי 100 לפני סיום העיכול עם 40 מיקרוליטרים של סרום בקר עוברי.

להרכיב את הנפח ל-10 מיליליטרים עם תווך בסיסי וצנטריפוגה לפני החייאה של החלקים האורגנואידים במטריצת מרתף קרה עם נפח מספיק כדי לעבור ביחס של 1:5 עד 1:10. מאוחר יותר, הוציאו 40 מיקרוליטרים של תרחיף אורגנואידי בכל באר של צלחת בעלת 24 בארות ותרבתו את הצלחת כפי שהודגם קודם לכן. כדי ליצור אורגנואידים תלת-ממדיים של דרכי הנשימה, יש לדגום את האורגנואידים של הריאה במדיום ההתפשטות למשך שבעה עד 10 ימים לאחר המעבר באמצעות גזירה מכנית.

לאחר מכן, החליפו את מדיום ההתפשטות במדיום התמיינות פרוקסימלית והכניסו את האורגנואידים לחממת תרביות תאים. לאחר 14 יום, השליכו את המדיום בכל באר והוסיפו חיץ ליזאט של תאים כדי לקצור את האורגנואיד המובחן של דרכי הנשימה לצורך מיצוי RNA וזיהוי ביטוי גנים תאיים על ידי בדיקת RT-qPCR. קדם הדגירה של התוספות בחממת תרביות התאים עם 250 ו-500 מיקרוליטרים של המדיום הבסיסי בתא העליון והתחתון של צלחת בת 24 בארות, בהתאמה.

לאחר מכן, הוסיפו מיליליטר אחד של מדיום בסיסי לצינור ופיפטה למעלה ולמטה כדי לגזוז את האורגנואידים לתאים בודדים. שימו לב לתאים מתחת למיקרוסקופ לפני שתסיימו את העיכול עם 40 מיקרוליטרים של סרום בקר עוברי. מסננים את התאים דרך מסננת של 40 מיקרון לתוך צינור של 50 מיליליטר ומעבירים את תרחיף התא המסונן לצינור של 15 מיליליטר.

מלאו את המתלים במדיום בסיסי עד נפח כולל של 10 מיליליטר. לאחר צנטריפוגה, החייאת הכדור שנאסף מ-24 טיפות ב-1 עד 2.5 מיליליטר של מדיום התפשטות האורגנואידים של הריאה, בהתאם לצפיפות התא. ספרו את מספר התאים עם מונה התאים מתחת למיקרוסקופ, ואז התאימו את ריכוז התאים ל-1.3 פעמים 10 ל-6 למיליליטר עבור תוספות של 24 בארות.

הסר את התווך הבסיסי מהתאים העליונים והתחתונים לפני הוספת 500 מיקרוליטרים של מדיום הרחבה בתא התחתון. זרע 100 מיקרוליטרים של תרחיף התא שהוכנו מוקדם יותר על התא האפיקלי של 24 הקידוחים מוכנסים ודגירה. לאחר יומיים, החליפו את מדיום ההתפשטות במדיום דיפרנציאציה פרוקסימלי הן בתא האפי והן בתא התחתון של הצלחת.

דגירה של האורגנואידים למשך 14 יום ורענן את המדיום כל שלושה ימים. מודדים את ההתנגדות החשמלית הטרנס-אפיתליאלית מדי יום באמצעות מערכת למדידת התנגדות חשמלית. במיקרופוטוגרף המייצג, ניתן לראות את תאי הריאה המבודדים הטריים מוטבעים במטריצת ממברנת מרתף של גורם גדילה מופחת סוג 2.

האורגנואידים הציסטיים הופיעו וגדלו עם הזמן. האורגנואידים הריאתיים לאחר המעבר הרביעי מודגמים כאן. תוך שעתיים מרגע הגזירה המכנית, השברים האורגנואידים המוטמעים בתמצית קרום המרתף יצרו את התחומים הציסטיים.

המיקרו-צילום של אותו שדה ביום החמישי אישר את צמיחת האורגנואידים לאורך זמן. האורגנואידים המתרחבים הכילו את כל ארבעת סוגי תאי האפיתל העיקריים של דרכי הנשימה, כולל תא ציליאלי חיובי ל-ACCTUB או FOXJ1 חיובי, תא בסיס חיובי ל-P63, תא מועדון חיובי ל-CC10 ותא גביע חיובי ל-MUC5AC במצב מוקדם מדי. האורגנואידים שהודגמו במדיום ההתפשטות וההתמיינות הפרוקסימלי פיתחו מורפולוגיה מובחנת לאורך זמן.

לאחר שבועיים של התמיינות במדיום ההתמיינות הפרוקסימלית, ניתן היה להבחין בריסונים תנועתיים בכל אורגנואיד. נצפה כי סיליה המכה באופן סינכרוני הניעה את פסולת התאים בתוך לומן האורגנואידי וסובבה אותם באופן חד כיווני כדי להסיר את החלקיקים השאפויים. יתר על כן, ניתוח הציטומטריה של הזרימה הראה כי האורגנואידים המובחנים התאימו לארבעה סוגי תאי אפיתל של דרכי הנשימה במדיום התמיינות והתפשטות פרוקסימליים.

לאחר שבועיים של התמיינות, אורגנואידים דו-ממדיים של דרכי הנשימה פיתחו מחסום אפיתל שלם. בדיקת חסימה של דקסטרן בוצעה כדי להעריך את שלמות מחסום האפיתל שנוצר באורגנואידים דו-ממדיים של דרכי הנשימה. האורגנואידים הדו-ממדיים הכילו שפע של תאים מצויסים.

האורגנואידים של הריאה הניתנים להרחבה ארוכת טווח והאורגנואידים המובחנים של דרכי הנשימה מספקים מערכת מודלים פעילה מבחינה פיזיולוגית ואוניברסלית לחקר ביולוגיה ופתולוגיה של הנשימה, כולל COVID-19.