פרוטוקול זה מאפשר לחקור את הפוטנציאל והיכולת של Muller glia להמיר לתאי אב ברשתית לאחר טיפול בגורמים ספציפיים כגון מיקרו-רנ"א. היתרון של טכניקה זו הוא שניתן לבחון מועמדים למיקרו-רנ"א על יעילותם ותוצאותיהם לפני השימוש בהם ביישומי in vivo. מי שיעזור להדגים את ההליך יהיה Seoyoung Kang, סטודנט לדוקטורט מהמעבדה של סטפני וואהל.
ראשית, טבלו את גלגל העין שהוסר לזמן קצר לתוך צינור עם אתנול כדי למנוע נשיאה של חיידקים מהחיה. לאחר מכן, לשטוף את גלגל העין לזמן קצר בצלחת פטרי 10 ס"מ לפני הנחתו לתוך צלחת 24 באר על קרח. לאחר הסרת גלגלי העיניים וניקוים, הניחו עין אחת בכלי הנתיחה הממוקמת מתחת למיקרוסקופ מנתח עם מקור אור.
כעת תקן גלגל עין אחד על ידי תפיסת עצב הראייה ורקמת החיבור שמסביב סביב הסקלרה עם מלקחיים עדינים של Dumont 5 ולחץ עליו בזהירות כנגד צלחת הנתיחה. לאחר מכן, צור חור במרכז הקרנית באמצעות מחט 30 מד כדי לאפשר גישה קלה יותר למספריים הוורידיים. לאחר מכן, נתחו את הקרנית סביב הגוף הציליארי באמצעות מספריים ורידיים והסירו בזהירות את הקרנית, העדשה, הקשתית והגוף הזגוגי בעזרת מלקחיים עדינים של Dumont 5.
מאוחר יותר לנתח את הסקלרה עם מספריים ורידיים עד שמגיעים לעצב הראייה ולחלץ בזהירות את הרשתית באמצעות Dumont 5 מלקחיים עדינים. עכשיו להשתמש השני Dumont 5 מלקחיים עדינים לדחוף נגד הרשתית לחלוטין להסיר את הגוף הזגוגי. מעבירים את הרשתיות לחתוך כ 2.5 ס"מ של קצה פיפטה העברה סטרילית כדי להגדיל את הקוטר.
כעת, בעזרת קצה זה, הרימו רשתיות שלמות מבלי לפגוע ברקמה והעבירו את הרשתיות לצלחת פטרי סטרילית חדשה עם HBSS קר ונדנדו את המנה. לאחר מכן, באמצעות פיפטה העברה סטרילית חדשה, דחפו בזהירות את הרשתיות מסביב כדי לשטוף את תאי אפיתל פיגמנט הרשתית. מיד מניחים את הרשתית המבודדת בבאר נקייה חדשה של צלחת 24 הבאר המלאה במיליליטר אחד של HBSS תוך שמירה על צלחת 24 הבאר על הקרח במהלך הנתיחה.
הכינו את תערובת הדיסוציאציה של פפאין DNase I כמתואר בכתב היד. עכשיו עם פיפטה העברת קצה מוגדל, להרים את הרשתיות. המתן עד שהרשתיות ישקעו בתחתית הקצה ושחרר את הרשתיות ללא HBSS מוגזם לתוך הצינור המכיל תערובת פפאין DNase I.
לאחר מכן, מניחים את הצינור על נוטור באינקובטור ודוגרים במשך 10 דקות ב 37 מעלות צלזיוס ועם 5% פחמן דו חמצני. לאחר מכן, לנתק את התאים על ידי pipetting בזהירות למעלה ולמטה עם פיפטה מיליליטר אחד. לאחר ניתוק התאים, הוסיפו 275 מיקרוליטרים של מעכב פרוטאז אובומוקואידי מתוך ערכת הדיסוציאציה של פפאין כדי לנטרל את הפפאין ולערבב בעדינות על ידי פיפטינג למעלה ולמטה.
מכניסים צינורות לתוך צנטריפוגה ומסתובבים בארבע מעלות צלזיוס במשך שמונה דקות בעוצמה צנטריפוגלית יחסית של 300. הוסף את גורם הצמיחה האפידרמלי לנפח המחושב של מדיום הצמיחה שהתחמם מראש ב-37 מעלות צלזיוס. הסר את הצינורות בזהירות מהצנטריפוגה.
מבלי לגעת בכדור שבתחתית הצינור, יש להסיר את הסופר-נטנט בזהירות ובאופן מלא. עכשיו להשעות את גלולת התא עם 500 microliters של גורם גדילה אפידרמלי בתוספת מדיום גדילה. לאחר מכן, העבר את מתלה התא לבאר אחת של צלחת 12 הבאר המסומנת.
שטפו את הצינור בעוד 500 מיקרוליטרים של גורם הגדילה האפידרמלי בתוספת מדיום גדילה והוסיפו אותו לבאר. נדנדו את צלחת הבאר בזהירות ואז הניחו את הצלחת באינקובטור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם פחמן דו חמצני. התחל על-ידי בדיקת מפגש תאים של 90% עד 100%.
לאחר מכן, להסיר את המדיום ולהוסיף מיליליטר אחד של HBSS קר לשטוף את הבאר. נדנדנדו בעדינות את הצלחת והסירו את HBSS ללא עקבות שנותרו. מאוחר יותר, להוסיף 500 microliters של טריפסין מחומם מראש המכיל תמיסה כדי לנתק את התאים מן הבאר.
רוק בעדינות ודגרה במשך שתי דקות בחממה של 37 מעלות צלזיוס. לאחר העברת הצלחת מהאינקובטור לארון הבטיחות הביולוגי, שאפו את התמיסה המכילה טריפסין תוך כדי הטיה. פזרו אותו בזהירות ובאיטיות על פני הבאר מספר פעמים עד שהתאים מתנתקים לחלוטין.
לאחר מכן, להעביר את זה השעיה התא צינור סטרילי 1.5 מיליליטר ולשים צינורות לתוך צנטריפוגה. סובבו 300 פעמים גרם במשך שמונה דקות בארבע מעלות צלזיוס והחזירו צינורות לארון הבטיחות הביולוגי. יש להסיר את הסופר-נטנט מבלי לגעת בכדור.
כעת יש להשעות בזהירות את גלולת התא על ידי הוספת 600 מיקרוליטרים של מדיום גדילה שחומם מראש וצינורות למעלה ולמטה כ-30 עד 40 פעמים. לבסוף, זרע 100 מיקרוליטר של ההשעיה התא המתקבל במרכז שישה תלושי כיסוי מצופים של צלחת 24 באר. הניחו את הצלחת על האינקובטור ותנו לתאים להסתפק בטרנספקציה הבאה באמצעות חיקוי מיקרו-רנ"א.
האיור מראה תנאי בקרה חמישה ימים לאחר ההעברה עם כמה תאים חיוביים Ascl1-Tomato נוכחים. עם זאת, לאחר טיפול miR-25, נמצאו תאים חיוביים רבים נוספים של Ascl1-Tomato. הכימות גילה עלייה של פי ארבעה במספר התאים החיוביים Ascl1-Tomato בבארות שטופלו ב-miR-25 בהשוואה לקבוצת הביקורת.
והכי חשוב, הרוב המכריע של התאים החיוביים Ascl1-Tomato שנמצאו בבארות שטופלו ב-riR-25 אימצו מורפולוגיה עצבית. תכונות של מורפולוגיה עצבית זו כללו גודל סומה תא מופחת, פיתוח של תהליכים עדינים והיווצרות של רשתות זעירות. הכימות גילה כי כ-70% מכל התאים החיוביים ל-Ascl1-Tomato היו בעלי תכונות עצביות.
תיוג אימונופלואורסצנטי מראה כי תאים חיוביים Ascl1-Tomato עם מורפולוגיה עצבית מבטאים את הסמנים העצביים OTX2 ו- MAP2, המאשרים את הזהות העצבית. הכימות של תאים אלה גילה כי לאחר ביטוי יתר של miR-25, קיימים כ-40 תאי עצב חיוביים ל-Ascl1-Tomato לכל שדה, בהשוואה לחמישה תאים עצביים לכל שדה בבקרות. תאי העצב שזוהו מהווים כ-70% מכלל אוכלוסיית התאים החיוביים Ascl1-Tomato של דגימות miR-25 שטופלו.
יתר על כן, כימות המספר המוחלט של תאי עצב בעלי ביטוי משותף של OTX2 ו-MAP2 הראה כי לאחר טיפול ב-miR-25, נמצאו כ-60 תאי עצב לכל שדה, לעומת 10 נוירונים לכל שדה בבקרות. חובה לעבוד בסביבה נקייה ומחוטאת עם כלים נקיים וסטריליים ולעבוד בזהירות על ידי הימנעות מכל טיפול קשה. יישומים במורד הזרם יכולים להיות, למשל, כימות חלבונים, ניתוח DNA או RNA, או מחקרים אלקטרופיזיולוגיים.
טכניקה זו סייעה לנו לחקור שאלות ראשוניות על תכנות מחדש גרעיני השייך לתחום הרפואה הרגנרטיבית. ויש מגוון רחב של גורמים ותנאים שניתן לבחון על מנת לחקור שאלות חדשות.
