פרוטוקולים אלה מאפשרים לחקור חסינות תורשתית למיקרוספורידיה. הטכניקות המוסברות כאן יכולות לעזור לנו להבין כיצד חסינות מועברת לאורך דורות ואת המולקולות הקובעות חסינות למיקרוספורידיה בצאצאים. C.elegans הוא מודל פשוט וניתן למתיחה גנטית עם זמן דור קצר לבדיקת תורשה.
הכלים הרבים הזמינים לתולעת יכולים לשמש לחשיפת מנגנונים מולקולריים של חסינות בין-דורית. בעת הדבקת חיות P0, השתמש במינון נבגים נמוך שאינו משפיע באופן משמעותי על יכולתו של ההורה לייצר צאצאים. זה מבטיח שהלבנה תניב מספיק בעלי חיים F1 לניסויים במורד הזרם כדי להתחיל, להעביר את המספר הנדרש של 10 ס"מ של לוחות בינוניים לצמיחת נמטודה בלתי נזרעת מ-4 מעלות צלזיוס לטמפרטורת החדר יום אחד לפני ההדבקות המתוכננות.
רגע לפני ההדבקה, גלולה למטה בערך 2, 500 תולעי L1 מסונכרנות בצינור microfuge ב 1, 400 פעמים G במשך 30 שניות. הסר את ה-supernatant עם קצה פיפטה כדי להשאיר תולעים ב-50 מיקרוליטרים של מדיה M9. הוסיפו מיליליטר אחד של זן Escherichia coli 10X OP50 לתולעים חד-שלבית, ונבגים מסוג N.parisii לריכוז הרצוי.
כבקרה לא נגועה, הכן צינור שווה ערך של L1s ו- OP50 עם נפח של מדיית M9 השווה לנפח הכנת הנבגים המשמש. מערבבים את דגימת התולעת L1 על ידי מערבולת קצרה ולוח מעל מיליליטר אחד של תולעים על לוחית בינונית של צמיחת נמטודה בלתי נזרעת באורך 10 סנטימטרים. מערבלים כדי לוודא שהנוזל מתפשט על פני כל הצלחת.
מייבשים את הצלחות בארון נקי עם המכסים כבויים למשך 10 עד 20 דקות או עד לייבוש מוחלט לפני דגירה בטמפרטורה של 21 מעלות צלזיוס למשך 72 שעות. בשעה 72 שעות לאחר ההדבקה, בדקו את הצלחות מתחת למיקרוסקופ הניתוח. הצלחת עם תולעים נגועות אמורה להכיל פחות עוברים מאשר הצלחות עם תולעים לא נגועות.
לאחר מכן לשטוף את התולעים מן הצלחות לתוך צינור microcentrifuge באמצעות מדיה M9 מיליליטר אחד. אם תולעים רבות נשארות על הלוחות, גלול את התולעים על ידי צנטריפוגה ב 1400 פעמים G במשך 30 שניות. מוציאים את הסופרנטנט ומבצעים שטיפות צלחת נוספות.
צנטריפוגה ב 1400 פעמים G במשך 30 שניות בטמפרטורת החדר כדי לכדורף את התולעים ולשטוף פעמיים עם מיליליטר אחד של מדיה M9 או עד שהסופרנאטנט ברור. להשעות אותו מחדש בכרך סופי של מדיית M9 מיליליטר אחת ולערבב היטב על ידי צנרת. העבירו 100 מיקרוליטרים של התולעים התלויות לצינור טרי והלבינו את 900 המיקרוליטרים הנותרים כדי לפתוח את התולעים הבוגרות ולשחרר עוברי F1 לבדיקה.
לבצע זיהומים עם שינויים. כפי שצוין בכתב היד. בשעה 72 שעות לאחר ההדבקה, בדקו צלחות תחת מיקרוסקופ מנתח.
הצלחת עם התולעים הנאיביות צריכה להיות קטנה יותר ולהכיל פחות עוברים מאשר הצלחות עם תולעים מורמות. לאחר מכן, התחל את תהליך ההכתמה והתיקון של התולעים על ידי שטיפתן מהצלחות לתוך צינור microcentrifuge באמצעות מיליליטר אחד של 0.1% Tween 20 במדיה M9. אם תולעים רבות נשארות על הלוחות, גלול את התולעים על ידי צנטריפוגה ב 1, 400 פעמים G במשך 30 שניות בטמפרטורת החדר, להסיר את supernatant באמצעות קצה פיפטה, ולבצע שטיפות צלחות נוספות.
לאחר שכדור התולעים על ידי צנטריפוגה במשך 30 שניות ב-1, 400 פעמים G בטמפרטורת החדר, שטפו פעמיים עם מיליליטר אחד של מדיה M9 המכילה 0.1%Tween 20 או עד שהסופרנאטנט ברור. הסר את ה-supernatant, הוסף 700 מיקרוליטרים של אצטון והשאר את התולעים לתקן בטמפרטורת החדר במשך 10 דקות. הוציאו את התולעים הקבועות האלה למשך 30 שניות ב-10, 000 פעמים G בטמפרטורת החדר ותנו שתי שטיפות של מלח חיץ אחד של מיליליטר פוספט המכיל 0.1% Tween 20.
הכינו 50 מיליליטרים של תמיסת עבודה DY96, עטפו את המיכל בנייר כסף ואחסנו אותו במגירה כדי למנוע חשיפה לאור. הוסיפו 500 מיקרוליטרים של תמיסת עבודה DY96 לכדור התולעת וסובבו במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר בחושך. צנטריפוגה תגובה זו במשך 30 שניות ב 10, 000 פעמים G בטמפרטורת החדר כדי לכדור את התולעים ולהסיר את supernatant.
לאחר מכן, הוסף 15 מיקרוליטרים של מדיום ההרכבה עם או בלי DAPI. פיפטה 10 מיקרוליטרים של התולעים המוכתמות האלה על מגלשת מיקרוסקופ ומניחים כיסוי מעל החלקה העליונה. כדי לנתח את התולעים המוכתמות ב-DY96 המותקנות על שקופיות, בצעו הדמיה באמצעות תעלת ה-GFP של מיקרוסקופ פלואורסצנטי.
כדי לקבוע את הכשירות של אוכלוסיות התולעים, השתמש במטרה של פי 5 או 10X כדי לבדוק את כוח המשיכה של יותר מ -100 תולעים לכל מצב. בשעה 72 שעות לאחר ההדבקה, חיות ה-F1 תוקנו והוכתמו ב-DY96 כדי להעריך את עמידות המיקרוספורידיה. אוכלוסיות הורים נגועות ובקרות לא נגועות תוקנו ב-72 שעות לאחר ההדבקה והוכתמו ב-DY96 כדי לדמיין את עוברי התולעים ואת נבגי המיקרוספורידיה.
בעלי חיים נגועים הם קטנים, מכילים נבגי מיקרוספורידיה רבים, ומייצרים פחות עוברים מאשר פקדים בריאים ולא נגועים. הערכת כוח המשיכה של התולעים הראתה כי כ-95% מבעלי החיים הלא נגועים ייצרו צאצאים, בהשוואה לבעלי החיים הנגועים, שהיו פחות מ-80% כימות גילתה שכ-90% מהאוכלוסייה שטופלה במיקרוספורידיה היו נגועים, כפי שנקבע על ידי מספר התולעים המכילות נבגים מוכתמים ב-DY96. כימותים של בעלי חיים קבועים אלה גילו כי התולעים הראשוניות הכילו הרבה יותר עוברים מאשר עמיתיהם הנאיביים, מה שמעיד על כושר טוב יותר מול זיהום.
פיג'י אימג'יי שימש לקביעת נטל הטפילים של תולעים נאיביות וחסינות בודדות, שהוא אחוז הגוף המלא בנבגי N.parisii פלואורסצנטיים. הכימותים חשפו ירידה דרמטית בנטל הטפילים של התולעים שהגיעו מהורים נגועים. יתר על כן, חישובי גודל התולעים האינדיבידואליים גילו כי לתולעים בעלות פריים היה יתרון גדילה משמעותי על פני בעלי חיים תמימים מול זיהום N.parisii.
מחקרי הדמיה גילו כי בעוד שבעלי חיים תמימים הכילו בדרך כלל נבגים מרובים וכמה תאים נגועים, לבעלי החיים הפגועים היו הרבה פחות נבגים או ללא נבגים ובדרך כלל לא היו ספורופלזמות. אם באוכלוסיות F1 לא מרוסקות ומזוהמות יש מספר דומה של בעלי חיים דביקים ומזוהמים, ספרו את מספר הביצים לכל חיה, וניתחו את הרקמה הנגועה ב-ImageJ כדי למצוא הבדלים עדינים יותר. בעוד צהוב ישיר 96 כתמים נבגים בוגרים, הכלאה פלואורסצנטית באתרה יכולה לחשוף ספורופלזמות בתוך התאים.
זה יכול להראות לך את מספר התאים הנגועים בתולעים מורמות ובלתי מרוסנות. טכניקות אלה הראו כי תגובת השעתוק ההורית יכולה לסייע בגרימת חסינות תורשתית אצל צאצאים. חוקרים חוקרים כעת את מהותה של חסינות זו אצל צאצאים.
