מחקר זה נתמך על ידי הקרן הלאומית למדע באמצעות מענקים PHY-1205494 ו- MCB-1413134 (EL) ועל ידי 2017R1D1A1B03035671 המענק של קרן המחקר הלאומי של קוריאה (KSL).

להלן הפרוטוקול משתמשת WormSpa5, מכשיר microfluidic שתואר קודם לכן עבור הדמיה האורך של תולעים. פבריקציה נוספת של WormSpa (החל עם קבצי CAD שניתן להשיג מן המחברים על פי בקשה) היא פשוטה אך דורש מומחיות כלשהי. ברוב המקרים, פבריקציה נוספת יכול בקלות להיעשות באמצעות מתקן ליבה או באמצעות חברה מסחרית המספק שירותים כאלה. כאשר בדיית המכשיר, הקפד לציין הגובה של התכונות הם 50 מיקרומטר.
1. הגדרת הניסוי
<ol><li>לטעון את המכשיר microfluidic על מיקרוסקופ פלורסצנטיות הפוך עם שלב ממונע.</li>
	<li>המקום של תפקודי לב / נשימה קרוב המיקרוסקופ, אך לוודא שהרטט מהמכשיר ניעור אינה משפיעה ישירות המיקרוסקופ. לדוגמה, לשים ניעור על מדף קבוע על הקיר שגורם שום קשר עם השולחן האופטי.</li>
	<li>במקום מזרק משאבה על ניעור מסלולית. קלטת את המשאבה על אהבת בשייקר כך זה לא מנענעת תוך טלטול.</li>
</ol>2. הכנת הסביבה Microfluidic
הערה: במהלך הניסוי, מזרקים ארבעה מחוברים למכשיר microfluidic דרך צינורות מזרק, כמתואר באיור1. שלב זה מתאר את הכנת מזרקים אלה. אלא אם צוין אחרת, לשמור על הצינורות מזרק קצר ככל האפשר מבלי לבצע אותם מתוח.
<ol><li>להכין מזרק עודפים של צינור מזרק. המזרק (S1 באיור1) מאוחר יותר להיות מחובר לשקע של המכשיר דרך הצינורית מזרק, המשמשים לאחסון זמני של נוזל יוצא המכשיר.<ol>
<li>להפוך את המחט מתאם על-ידי הסרת חלקי פלסטיק של קצה המזרק 20 G x 1/2 אינץ ', להשאיר רק את המחט (החלק מתכת). לעשות זאת באמצעות החזקת חלקי פלסטיק, מתכת עם צבת ומושך אותם בנפרד. שאריות פלסטיק הנותרים המחט יכול להיות נשרפו בעזרת מבער בונזן.</li>
		<li>לכופף את המחט לפי הצורה הגיאומטרית של ההתקנה ניסיוני תוך החזקת שני הקצוות שלה עם צבת. עיצוב המתוארים כאן, כיפוף המחט במרכזו בזווית של ° ~ 110 הוא הנוח ביותר.</li>
		<li>חבר את המחט מתאם בחצי הדרך ברכבת התחתית. החצי השני מאוחר יותר להיות פקוק לתוך המכשיר. הצינור מזרק צריך להיות תואם עם טיפ מזרק 20 גרם ללא דליפה (לדוגמה, אבובים עם הקוטר הפנימי של 0.86 מ מ, הקוטר החיצוני של 1.32 מ מ). אורך צינור המומלץ הוא ~ 50 ס מ.</li>
		<li>להתחבר מזרק זכוכית-lock 10 מ"ל (פתוח) בצד השני של הצינור מזרק דרך tip מזרק 20 G x 1/2 אינץ '.</li>
	</ol>
</li>
	<li>להכין מאגר-כניסת מזרקים, מזרק צינורות. אחד אלה מזרקים (S2 באיור1) משמש מאגר נוזל נכנס לתוך המכשיר, כדי לשלוט בזרימה הזרקה. המזרק אחרים (S3 באיור1) דרוש עבור מאגר exchange, כפי שהוסבר ב 3.2 שלב.<ol>
<li>חבר מזרק זכוכית-lock 10 מ"ל (S2) ישירות ל- 3-דרך שסתום וחבר אחר מזרק (S3) לשסתום באותה דרך צינור מזרק (איור 1): להתחבר S3 הצינור דרך tip מזרק, לחבר הצינור לשסתום באמצעות מזרק עצה נוספת. הערה: לא משנה הסדר שבו חומרים אלה מחוברים.</li>
		<li>חבר צינור מזרק ליציאת הנותרים של השסתום 3-way. להכין עוד מחט מתאם כמו שלב 2.1.2, ולחבר את המחט במחצית הדרך השני (פתוח) של הצינור מזרק.</li>
		<li>להגדיר את השסתום כך הצינור מזרק שלב 2.2.2, S2 מחוברים בזמן S3 סגורה (איור 1).</li>
	</ol>
</li>
	<li>להכין מזרק תולעת-כניסת צינור מזרק. המזרק (S4 באיור1) משמש עבור טעינת תולעים לתוך המכשיר.<ol>
<li>חבר צינור ארוך מזרק מזרק זכוכית-lock 10 מ"ל (S4). לקבוע את אורך הצינור הזה מאמצעי האחסון של נוזל ישמש עבור טעינה; לדוגמה, 100 ס מ של אבובים תומך מעל 2 מ ל נוזל (ראה גם שלב 4.2).</li>
		<li>להכין עוד מחט מתאם כמו שלב 2.1.2 וחבר אחד חצי של המחט לקצה השני (פתוח) של הצינור מזרק.</li>
	</ol>
</li>
	<li>לשטוף כל מזרקים, אבובים עם S-בינוני12 פעמיים. למלא את המזרקים, הצינורות S-בינוני, מקפיד להסיר את כל הבועות אוויר.</li>
	<li>לחבר את הצינור מזרק עודפים שקע המכשיר.<ol>
<li>חברו את המחט מתאם בסוף הצינור מזרק ליציאת ה-outlet.</li>
		<li>להזריק נפח קטן של S-בינוני עד ששקע כדי למלא את המכשיר, עד S קטן-בינוני יוצא לים מאגר והן לים תולעת.</li>
	</ol>
</li>
	<li>להתחבר הצינור מזרק מאגר-כניסת יציאת מאגר-כניסת של המכשיר, תוך חיבור לים-התולעת עם סיכה (סיכת פינים נירוסטה בקוטר 1/32 אינץ).</li>
	<li>מזריקים זרם קבוע של מאגר לתוך המכשיר. לטעון את המזרק מאגר-כניסת S2 אל משאבת מזרק13, והגדר את המשאבה כזה כי המדיום ב S2 ברציפות מוזרק לתוך המכשיר בקצב הזרימה של µL 3/min.</li>
</ol>3. להעמיס את חיידקים לתוך המכשיר Microfluidic
<ol><li>להכין OP50 Escherichia coli מושעה S-בינוני12.<ol>
<li>בעקבות פרוטוקול תקני, לחסן בקבוקון 250 מ ל 50 מ ל LB, שמושבה בודדת, דגירה בין לילה ב 37 º C.</li>
		<li>Centrifuge התרבות לילה ב- 4000 סל"ד למשך 10 דקות, resuspend בגדר ב30 מ"ל של S-בינוני.</li>
		<li>לסנן את המתלים דרך מסנן מזרק 5 מיקרומטר. למדוד את ריכוז חיידקים על ידי צפיפות אופטית שלה ב 600 nm (OD600), ולהתאים את ריכוז יתר600 של 3. צפיפות גבוהה זו נדרשת כדי לשמור את התולעים מוזן היטב.</li>
	</ol>
</li>
	<li>חילופי המאגר את ההתקן עם המתלה OP50.<ol>
<li>להכין מזרק נקי (S5) מלא את המתלים OP50. . תחזיק את המזרק אנכית, הקש על זה מספר פעמים כדי לאסוף את כל הבועות אוויר בחלק העליון.</li>
		<li>סובב את השסתום 3-way מזרקים מאגר-כניסת לסגור את החיבור להתקן, וחבר את שתי מזרקים, S2, S3. ולהיבלע S2 משאבת מזרק.</li>
		<li>נתק S2 השסתום וחבר S5 לשסתום. לדחוף את כל האוויר הנאסף בחלק העליון של S5 כדי S3 דרך השסתום עד קצת המאגר OP50 נכנס S3. בעשותו כן, ודא כי אין בועת האוויר נשאר S5 או את השסתום.</li>
		<li>להפוך את השסתום אסידו בחזרה למיקום המקורי כדי לסגור את חיבור בין S3 S5 ולהתחבר S5 המכשיר. העומס S5 לתוך למשאבה מזרק. הפעל את תפקודי לב / נשימה שמחזיק את המשאבה. הגדר את מהירות חזק כ 200 סל"ד.</li>
		<li>הגדר את קצב הזרימה כדי להיות µL 100/min. הזמן שהדרוש עבור מאגר חדש להגיע תולעים המכשיר תלויה אורך הצינור מזרק מאגר-כניסת (בסביבות 5 דקות עם הצנרת שתוארו לעיל). יכול להיות מועסק קצב זרימה גבוהה יותר אם נדרשת החלפת מאגר מהר יותר.</li>
		<li>ברגע המאגר OP50 מתפשטת על כל רחבי המתקן, להגדיר את קצב הזרימה לחזור µL 3/min.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. להעמיס את התולעים לתוך המכשיר Microfluidic
<ol><li>הכן צינור microcentrifuge קטן קשירה נמוכה (650 µL) ולמלא אותו µL 100 OP50 השעיה. העבר מסביב יאנג מסונכרן בגיל 20-30 תולעים בוגרות (46 שעות לאחר מעצר זחל L1 25 ° c) של צלחת אגר NGM (מדיום הגידול נמטודות) לשפופרת הזו על-ידי בחירת אותם אחד אחד עם תולעת לבחור. גיל-סנכרון יכול להיעשות בעקבות פרוטוקול סטנדרטי12.</li>
	<li>למלא את התולעת-הים מזרק, מזרק צינור (S4 באיור1) עם המתלה OP50. להזריק ~ 500 µL של הנוזל לתוך הצינור microcentrifuge עם תולעים. לצייר את הבולם עם תולעים לתוך מזרק תולעת-כניסת הצינור. ודא כי הצינור מזרק מספיק זמן (> 1 מ') מצויירות וורמס להישאר בצינור מזרק והוא לא להפוך כל הדרך אל המזרק S4.</li>
	<li>להתחבר S4 לים-התולעת. להזריק את כל התולעים בצינור מזרק תולעת-כניסה לתוך המכשיר microfluidic. נתק S4 ואת הצינור מזרק. חבר את התולעת-הים עם סיכה.</li>
	<li>. נתק את המזרק מאגר-כניסת S2 מהמשאבה מכני ( איור 1), לשלוט ידנית S1 ו- S2 לדחוף את כל התולעים לתוך ערוצים נפרדים. הקשה על S2 להעביר תולעים הערוצים, בזמן לחיצה על S1 יזיז אותם בכיוון ההפוך. פעם ערוץ נטען, התולעת בכל אחד מהערוצים יחסום את הכניסה של תולעים אחרים.</li>
	<li>תן תולעים להסתגל לסביבה חדשה עבור 2-3 שעות.</li>
</ol>5. הגדרת פרוטוקול הדמיה
<ol><li>למצוא את כל התולעים המצויות באופן מאובטח המכשיר וקבע עמדה הדמיה עבור כל אחד מהם בהתמונה רכישת התוכנה המפקחת שלך מיקרוסקופ. שימו לב כי במקרים מסוימים (למשל כאשר הגדלה גבוהה יותר היא הרצויה, או כאשר באמצעות מצלמות עם חיישן CCD קטן יותר) מספר עמדות הדמיה נדרשים לכל ערוץ. הערה: אמנם ניתן לבצע זאת באופן ידני, כמה חבילות תוכנה רכישה ניתן לטעון קובץ הטקסט המפרט את העמדות איפה צריך לקחת תמונות. מאז תפקידים אלה מסודרות באופן קבוע ב- WormSpa, משתמש יכול לכתוב סקריפט קטן (למשל, פיתון או תוכנה מסחרית) באופן אוטומטי יוצר רשימה כזו. התבנית המדויקת של קובץ script זה תלוי בתבנית הקובץ צפוי על ידי רכישת התוכנה (ראה למשל 1 חומר משלים).</li>
	<li>להגדיר את התדירות הנדרשת הדמיה בצילום מואץ. לדוגמה, נעשית הדמיה של ג'ין המערכת החיסונית בתגובה לזיהום בתדר של 10 דקות לכל מסגרת. ודא כי כל הערוצים הדרושים (למשל בהיר שדה, על ידי קרינה פלואורסצנטית GFP) נרכש בכל נקודת זמן.</li>
</ol>6. מארח בתגובה Pseudomonas זיהום
הערה: שלב זה הוא ספציפי ללמוד אינטראקציות פתוגן-פונדקאי. לחלופין, אחד יכולים להכין מאגר המכיל רמזים סביבתיים אחרים עניין (ביוטיים, והאביוטיים לחצים, סמים, איתות מולקולות, וכו ').
<ol><li>להכין PA14 Pseudomonas aeruginosa מושעה SK-בינוני14.<ol>
<li>לחסן בקבוקון 250 מ ל 50 מ ל LB, שמושבה בודדת, דגירה בין לילה ב 37 º C.</li>
		<li>לחסן את הבקבוק עוד 250 מ עם 50 מ של ליברות, על aliquot של התרבות, דגירה בין לילה ב 37 º C.</li>
		<li>Centrifuge התרבות לילה ב- 4000 סל"ד למשך 10 דקות, resuspend בגדר ב 10 מ ל SK-בינוני. למדוד את ריכוז חיידקי ולהתאים את ריכוז יתר600 = 4.</li>
		<li>להעביר את המתלים בקבוקון נקי, דגירה ב 37 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות ו- 25 ° c לעוד 24 שעות תוך כדי טלטול. שלב זה מחקה את הצעד צלחת-הדגירה בתקן הורג assay14.</li>
		<li>לסנן את המתלים דרך מסנן מזרק 5 מיקרומטר. זה כדי למנוע אגרגטים חיידקי וסותם את המכשיר.</li>
	</ol>
</li>
	<li>להחליף את הבולם OP50 במכשיר המתלה PA14, באותו ההליך כמו 3.2 שלב. לשמור על הדמיה במשך 10 שעות.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Lopez-Maury, L., Marguerat, S., Bahler, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tuning+gene+expression+to+changing+environments:+from+rapid+responses+to+evolutionary+adaptation.">Tuning gene expression to changing environments: from rapid responses to evolutionary adaptation.</a> Nat Rev Genet. 9 (8), 583-593 (2008).</li><li>de Nadal, E., Ammerer, G., Posas, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlling+gene+expression+in+response+to+stress.">Controlling gene expression in response to stress.</a> Nat Rev Genet. 12 (12), 833-845 (2011).</li><li>Hulme, S. E., Shevkoplyas, S. S., Samuel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidics:+Streamlining+discovery+in+worm+biology.">Microfluidics: Streamlining discovery in worm biology.</a> Nat Methods. 5 (7), 589-590 (2008).</li><li>San-Miguel, A., Lu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidics+as+a+tool+for+C.+elegans+research.">Microfluidics as a tool for C. elegans research.</a> WormBook. , (2013).</li><li>Kopito, R. B., Levine, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Durable+spatiotemporal+surveillance+of+Caenorhabditis+elegans+response+to+environmental+cues.">Durable spatiotemporal surveillance of Caenorhabditis elegans response to environmental cues.</a> Lab Chip. 14 (4), 764-770 (2014).</li><li>Mishra, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+microfluidics+chips+for+live+imaging+and+study+of+injury+Responses+in+Drosophila+larvae.">Using microfluidics chips for live imaging and study of injury Responses in Drosophila larvae.</a> J Vis Exp. (84), e50998 (2014).</li><li>Grisi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NMR+spectroscopy+of+single+sub-nL+ova+with+inductive+ultra-compact+single-chip+probes.">NMR spectroscopy of single sub-nL ova with inductive ultra-compact single-chip probes.</a> Sci Rep. 7, 44670 (2017).</li><li>Crane, M. M., Chung, K., Stirman, J., Lu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidics-enabled+phenotyping,+imaging,+and+screening+of+multicellular+organisms.">Microfluidics-enabled phenotyping, imaging, and screening of multicellular organisms.</a> Lab Chip. 10 (12), 1509-1517 (2010).</li><li>Leifer, A. M., Fang-Yen, C., Gershow, M., Alkema, M. J., Samuel, A. D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetic+manipulation+of+neural+activity+in+freely+moving+Caenorhabditis+elegans.">Optogenetic manipulation of neural activity in freely moving Caenorhabditis elegans.</a> Nat Meth. 8 (2), 147-152 (2011).</li><li>Lee, K. S., Lee, L. E., Levine, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HandKAchip+-+Hands-free+killing+assay+on+a+chip.">HandKAchip - Hands-free killing assay on a chip.</a> Sci Rep. 6, 35862 (2016).</li><li>Lee, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serotonin-dependent+kinetics+of+feeding+bursts+underlie+a+graded+response+to+food+availability+in+C.+elegans.">Serotonin-dependent kinetics of feeding bursts underlie a graded response to food availability in C. elegans.</a> Nat Commun. 8, 14221 (2017).</li><li>Stiernagle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintenance+of+C.+elegans.">Maintenance of C. elegans.</a> WormBook. , (2006).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> NE-1000 Series of Programmable Syringe Pumps. , (2017).</li><li>Tan, M. W., Mahajan-Miklos, S., Ausubel, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Killing+of+Caenorhabditis+elegans+by+Pseudomonas+aeruginosa+used+to+model+mammalian+bacterial+pathogenesis.">Killing of Caenorhabditis elegans by Pseudomonas aeruginosa used to model mammalian bacterial pathogenesis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (2), 715-720 (1999).</li><li>Kim, D. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+conserved+p38+MAP+kinase+pathway+in+Caenorhabditis+elegans+innate+immunity.">A conserved p38 MAP kinase pathway in Caenorhabditis elegans innate immunity.</a> Science. 297 (5581), 623-626 (2002).</li><li>Troemel, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p38+MAPK+regulates+expression+of+immune+response+genes+and+contributes+to+longevity+in+C.+elegans.">p38 MAPK regulates expression of immune response genes and contributes to longevity in C. elegans.</a> PLoS Genet. 2 (11), 183 (2006).</li><li>Estes, K. A., Dunbar, T. L., Powell, J. R., Ausubel, F. M., Troemel, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=bZIP+transcription+factor+zip-2+mediates+an+early+response+to+Pseudomonas+aeruginosa+infection+in+Caenorhabditis+elegans.">bZIP transcription factor zip-2 mediates an early response to Pseudomonas aeruginosa infection in Caenorhabditis elegans.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (5), 2153-2158 (2010).</li><li>Byerly, L., Cassada, R. C., Russell, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+life+cycle+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans:+I.+Wild-type+growth+and+reproduction.">The life cycle of the nematode Caenorhabditis elegans: I. Wild-type growth and reproduction.</a> Dev Biol. 51 (1), 23-33 (1976).</li><li>Chalancon, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interplay+between+gene+expression+noise+and+regulatory+network+architecture.">Interplay between gene expression noise and regulatory network architecture.</a> Trends Genet. 28 (5), 221-232 (2012).</li><li>Sanchez, A., Choubey, S., Kondev, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+noise+in+gene+expression.">Regulation of noise in gene expression.</a> Annu Rev Biophys. 42, 469-491 (2013).</li><li>Norman, T. M., Lord, N. D., Paulsson, J., Losick, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stochastic+Switching+of+Cell+Fate+in+Microbes.">Stochastic Switching of Cell Fate in Microbes.</a> Annu Rev Microbiol. 69, 381-403 (2015).</li><li>Gardner, T. S., di Bernardo, D., Lorenz, D., Collins, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inferring+genetic+networks+and+identifying+compound+mode+of+action+via+expression+profiling.">Inferring genetic networks and identifying compound mode of action via expression profiling.</a> Science. 301 (5629), 102-105 (2003).</li><li>Samuelson, A. V., Carr, C. E., Ruvkun, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+activities+that+mediate+increased+life+span+of+C.+elegans+insulin-like+signaling+mutants.">Gene activities that mediate increased life span of C. elegans insulin-like signaling mutants.</a> Genes Dev. 21 (22), 2976-2994 (2007).</li><li>Edwards, C. B., Copes, N., Brito, A. G., Canfield, J., Bradshaw, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Malate+and+Fumarate+Extend+Lifespan+in+Caenorhabditis+elegans.">Malate and Fumarate Extend Lifespan in Caenorhabditis elegans.</a> PLoS ONE. 8 (3), 58345 (2013).</li><li>Riddle, D. L., Blumenthal, T., Meyer, B. J., Priess, J. R., Riddle, D. L., Blumenthal, T., Meyer, B. J., Priess, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> C. elegans II. , (1997).</li><li>Churgin, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Longitudinal+imaging+of+Caenorhabditis+elegans+in+a+microfabricated+device+reveals+variation+in+behavioral+decline+during+aging.">Longitudinal imaging of Caenorhabditis elegans in a microfabricated device reveals variation in behavioral decline during aging.</a> eLife. 6, 26652 (2017).</li><li>Scholz, M., Lynch, D. J., Lee, K. S., Levine, E., Biron, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+scalable+method+for+automatically+measuring+pharyngeal+pumping+in+C.+elegans.">A scalable method for automatically measuring pharyngeal pumping in C. elegans.</a> J Neurosci Methods. 274, 172-178 (2016).</li><li>Scholz, M., Dinner, A. R., Levine, E., Biron, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stochastic+feeding+dynamics+arise+from+the+need+for+information+and+energy.">Stochastic feeding dynamics arise from the need for information and energy.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 114 (35), 9261-9266 (2017).</li></ol>

המחברים אין לחשוף.

Microfluidic כלים מספקים יתרונות רבים בלימוד תולעים. התקן דימות in PDMS מציע איכות הדמיה גבוהה יותר לעומת צלחת אגר NGM סטנדרטי. ניתן לקחת תמונות מרובות של תולעת יחיד, לעומת שיטות מסורתיות שבו בעלי חיים הרים מהצלחת והוקמה בשקופית מיקרוסקופ עבור הדמיה. בנוסף, ניתן לשמור את microenvironment שבו שוכנים תולעים קבוע או מאופנן לפי הצורך, המתיר מדויק מיפוי בין ההרכב של הסביבה ואת התגובה של בעלי החיים.
כאן להדגים כיצד לבצע מדידה האורך של התגובה לארח זיהום חיידקי על ידי הדמיה התגובה של תולעים בודדים מרובים לגורם המחלה הזדמנותית aeruginosa פ PA14 באמצעות התקן מותאם אישית microfluidic (WormSpa). שדה בהיר וגם קרינה פלואורסצנטית התמונות צולמו ב מספר פעמים ללא perturbing הניסוי מתמשך. בפרט, קינטיקה של הטלת ביצים, בביטוי הגן irg-1 היו ובחן כל 10 דקות, עלייה משמעותית ברזולוציה הטמפורלית מעל שיטות מסורתיות14,15.
במכשיר הזה, מידות האורך של תולעים מרובים יכול להתבצע על ידי המחודשת המיקום השמור של כל תולעת בכל זמן נתון. זה הודגם ב 2 דמויותC ו- 3B, איפה אנחנו לכמת את irg-1:: GFP פלורסצנטיות וביצים שמטילים תולעים בודדים. הנתונים האלה מראים כי תולעים להציג מגוון רחב של פרופילים קינטי. כפי שמוצג בעבר מחקרים תא בודד19,20,21, ושכלי יכול לשמש כדי להבין את העיצוב של מעגלים גנטית, כמו גם המתאם בין מסלולים ברורים19, 22.
לניסויים מוצלחת, חיוני כדי לטעון תולעים לתוך המכשיר microfluidic במהירות. בעוד תולעים לזחול על השטח אגר, הם נוטים ת'ראש בסביבה נוזלית ומשרה התנהגות זו תוכנית גנטית שבה המגבר מופעל חלבונים kinases הם מעורבים23,24. כדי לצמצם את ההפרעות לא רצוי, חשוב למקם את התולעים לחדריהם נפרד במהירות, כמו מזערים החדר, את החדירות אוויר של PDMS לספק תולעים עם סביבה המחקה משטח מוצק. 5 למרות הפעלת לחץ גבוה עוזר תולעים טעינה מהר יותר, מתאים לחץ המכשיר מדי עשויה לגרום ללחץ מכני על התולעים. תולעים קשות לחוצה לעשות לא להאכיל או להטיל ביצים, וכתוצאה מכך פנוטיפ שאלסי בבירור הנצפה25. לאחר הטעינה, תולעים אכלו e. coli OP50 במשך 2-3 שעות, המאפשר את התולעים להתאים לסביבה microfluidic ומספקת החוקר הזדמנות להתבונן החיות ולמחוק את אלה שניזוקו.
גודל ואת הריווח של מזערים בכל אחד הממוטבות התולעים גדלו 46 שעות ממעצרו L1 ב 25 º C. המבנים עשוי להיות מדרגיים ללמוד תולעים מבוגר או מופחתת לבחון את הזחלים L4 קטנים בגודלם. עם זאת, תולעים אינם מסוגלים בהצלחה הנשירה בבית הבליעה, מסלק חקר התפתחות פוסט במכשיר הזה. עבור יישומים כאלה, שיטות כמו WorMotel26 עשויים להיחשב. מאז תולעים מוגבל אך לא מרותק למיטה בטיפול WormSpa, עמיד ניסוי יירוט מוצלח תלוי אם החיות להישאר בבית הבליעה. אנו מוצאים כי זה יכול להיות מאתגר עבור הזחלים בשלב מוקדם, למבוגרים זכר ועבור כמה מוטציות דו-מיניים.
במקום להשתמש עם כניסת מאגר יחיד (במרכז העליון, איור 1), פתחי הכניסה שני בצורת בלון הפוך יכול לשמש בו זמנית. ממלא את שני מזרקים עם מאגרים שונים, אחד ליצור סביבות חנותם מובנים על ידי לחיצה על מזרקים שונים בזמן שונה. זה, לדוגמה, מאפשר לימוד של הסתגלות לשינוי הסביבה. 27 , 28
כפי שהוזכר לעיל, המכשיר microfluidic המתוארים כאן יכול לשמש למגוון רחב של יישומים אחרים. אלה כוללים לימוד התגובות רמזים סביבתיים אחרים. תגובות כאלה עשויים לכלול שינויים ביטוי גנים, כנס התנהגויות, כפי שהודגם כאן, אבל גם לשינויים הצטברות שומן ומטבוליזם (למשל באמצעות שמן מכתים מאת Red הנילוס), פיזיולוגיה עצביים והאיתות (למשל על ידי סידן הדמיה ו- optogenetic לפליטת), שינויים בהתנהגויות מוטוריים כגון שאיבה, עשיית צרכים, ראש התנועה (באמצעות הדמיה כמותיים אוטומטיות של רצפי זמן לשגות) ועוד.
בסופו של דבר, גישה זו היא במידה רבה אוטומטית ומפחית את העבודה הנדרש לניסויים ארוך במשך שעות רבות, אפילו ימים. ברגע המיקומים של תולעים בודדים נשמרים נתונים רכישת התוכנה, הניסוי מורכב הקלטה אוטומטית של תמונות בזמן הבקר משאבה מכנית שומרת על שטף קבוע של מאגר לתוך המכשיר. חשוב, ייצור של מכשיר WormSpa אינה דורשת בכל פרוטוקול ליתוגרפיה רך יותר סטנדרטי, עיצוב ותפעול שלה הם מספיק פשוט אפילו לחוקרים ללא ניסיון קודם מיקרופלואידיקה. עם יתרונות שנדונו לעיל, הכנה פשוטה יחסית שלבים שונים, גישה זו יכולה להיות מועיל לאלה השוקלים מדידת האורך של תולעים חיות בתנאים מבוקרים בדיוק.

השינויים בתנאי הסביבה עלולה להוביל ההפעלה של תוכניות גנטי בליווי אינדוקציה ודיכוי של הביטוי של גנים ספציפיים1,2. שינויים אלה קינטי עשוי להיות משתנה בין הרקמות החיות באותה, בין בעלי חיים שונים. מחקרים של תוכניות כאלה גנטי ולכן קוראים שיטות לאפשר הדמיה האורך של חיות בודדות ומספקים שליטה מדויקת דינמיות של תנאים סביבתיים.
בשנים האחרונות, microfabricated פלואידים שימשו ללמוד היבטים רבים של התגובה וההתנהגות חיות קטנות, כולל תולעים, זבובים, דובוני מים עוד3,4,5,6, 7. יישומים לכלול, לדוגמה, phenotyping עמוק, optogenetic הקלטה של פעילות. עצבית בתגובה לגירויים כימיים, ומעקב אחר של התנהגויות מוטוריות כגון גפיים ו-8,שאיבה9,10 , 11.
גישות Microfluidic להחזיק נכסים רבים יכול להועיל ארוכת טווח אורכי הדמיה של תגובה לאותות סביבתיים, לרבות שליטה מדויקת דינמיות של microenvironment המקומי, עיצוב גמיש המאפשר קיום חיות בודדות רבעים נפרדים, וכן תכונות חיוביות עבור הדמיה. אולם, שמירה על בעלי חיים בתוך תא microfluidic במשך זמן רב עם השפעה שלילית מינימלית על בני שלהם היטב הוא אתגר, המחייב טיפול מסוים בעיצוב של המכשיר microfluidic, כמו גם ביצוע הניסוי.
כאן אנחנו מדגימים את השימוש WormSpa, מכשיר microfluidic עבור הדמיה האורך של Caenorhabditis elegans. 5 תולעים בודדים מרותק צ'יימברס. שוטף נמוכה של השעיה נוזלי ובקטריאליות ערבויות כי תולעים הם מוזן היטב ופעיל מספיק כדי לשמור על בריאות טובה, להקל על הלחץ, המבנה של התאים מאפשר תולעים להטיל ביצים. הפשטות של העיצוב ואופן הפעולה של WormSpa צריך לאפשר חוקרים ללא נסיון ב מיקרופלואידיקה לשלב התקן זה תוכניות מחקר משלהם.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1012px;" width="1011">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">WormSpa</td>
			<td style="width:123px;">N/A</td>
			<td style="width:344px;">N/A</td>
			<td style="width:329px;">The CAD file for WormSpa is available from the Levine lab.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Compound Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>AxioObserver Z1</td>
			<td>An inverted fluorescence microscope with a motorized stage</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Syringe Pump</td>
			<td>New Era Pump Systems</td>
			<td>NE-501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Tubing</td>
			<td>SCI Scientific Commodities Inc.</td>
			<td>BB31695-PE/5</td>
			<td>0.034&#8221; (0.86 mm) I.D. x 0.052&#8221; (1.32 mm) O.D</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Syringe Tip</td>
			<td>CMLsupply</td>
			<td>901-20-050</td>
			<td>20 Gauge x 1/2&#8221; blunt tip stainless steel canula</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Syringe Filter</td>
			<td>PALL</td>
			<td>4650</td>
			<td>Acrodisc 32 mm Syringe Filter with 5 um Supor Membrane</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Syringe</td>
			<td>Qosina</td>
			<td>C3307</td>
			<td>10 mL Male Luer Lock Syringe</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">3 Way Valve</td>
			<td>ColeParmer</td>
			<td>FF-30600-23</td>
			<td>Large-bore 3-way, male-lock, stopcocks, 10/pack, Non-sterile</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Dowel Pin</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>90145A317</td>
			<td>18-8 Stainless Steel Dowel Pins (1/32&#34; Dia. x 1/2&#34; Lg.)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Low Binding Microcentrifuge Tube</td>
			<td style="width:123px;">Corning</td>
			<td>CL S3206</td>
			<td>0.65 mL low binding snap cap microcentrifuge tube</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a microfluidic platform for longitudinal imaging in caenorhabditis elegans

בעשור האחרון, microfluidic הוחלו ללמוד חיות קטנות, כולל את תולעים נימיות Caenorhabditis elegans, וטכניקות הוכיחו שימושי כמו פלטפורמה נוחה הדמיה חיה מתן יכולות לשליטה מדויקת של תנאים ניסיוני בזמן אמת. במאמר זה נדגים הדמיה חיה של תולעים בודדים העסקת WormSpa, מכשיר שפורסמו קודם לכן microfluidic מותאם אישית. את ההתקן, תולעים מרובים נכלאים בנפרד כדי להפריד בין תאי, ומאפשר מעקב מרובבת האורך של תהליכים ביולוגיים שונים. כדי להמחיש את היכולת, אנחנו ביצע ניסויים הוכחה של עקרון בו תולעים נדבקו את ההתקן עם חיידקים פתוגניים, וכל הדינמיקה של ביטוי גנים התגובה החיסונית ביצה הנחת נוטרו באופן רציף של הפרט בעלי חיים. פשוט העיצוב ואופן הפעולה של מכשיר זה הופכים אותו למתאים עבור משתמשים עם לא נסיון עם microfluidic מבוסס ניסויים. אנו מציעים כי גישה זו יהיה שימושי עבור חוקרים רבים מעוניינים תצפיות האורך של תהליכים ביולוגיים בתנאים מוגדרים היטב.

גיל-מסונכרנות צעיר תולעים בוגרות (46 שעות פוסט L1 מעצר זחל 25 ° c)12 היו הכניסו את המכשיר, כמפורט בפרוטוקול. . התולעים היו בנפרד ממוקם ערוצים נפרדים, המאפשרים מדידה האורך של התגובה של בעלי החיים לגורם המחלה. כאשר הניסוי המוצלח, מרבית התולעים נשארים ערוצי שלהם משך זמן הניסוי. במקרה זה, תמונות של תולעים בודדים נלקחים פשוט על-ידי הצבת את הערוץ שלהם בדרך הדמיה, ולהימנע מהצורך לאתר באופן פעיל את החיה. איור 2 A מציג את התמונות בהיר-שדה של תולעת נציג יחיד במשך 10 שעות במכשיר. בעוד תולעים כלואות ערוצי שלהם, הם יכולים להעביר למעלה - ויוצאת, בחופשיות יכול להפוך את ראשיהם. זה חיוני כדי להבטיח כי ההתקן עצמו לא לגרום ללחץ או לפגוע החיות.
אנחנו פיקוח התגובה של תולעים זיהום חיידקי על ידי פ aeruginosa, אחד של פתוגנים חיידקיים למד ביותר של C. elegans. . זה גם פתוגניות הזדמנותית, אשר גורם זיהום ב סיסטיק פיברוזיס ומטופלים immunocompromised... האכלה תולעים עם זנים מסוימים של aeruginosa פ, כגון PA14, מוביל זיהום מעיים קטלני, לבודד קליני הגורמים התקפה אלימה מעורב בתהליך זה הם גם מעורבים הזיהום של המארחים יונקים. 14 , 15
כדי לבחון את הדפוס של שינויים בביטוי הגנים במהלך זיהום חיידקי, כתבים פלורסנט יכול להיות מועסק. בין גנים רבים המציגים תגובה דינמית לזיהום, אנחנו במעקב התגובה תעתיק של irg-1 (זיהום התגובה ג'ין 1), על ידי הדמיה קרינה פלואורסצנטית GFP מן התולעים הטרנסגניים לבטא irg-1::GFP (AU0133 [agIs17 ( pirg-1::GFP; pmyo-2::mCherry)], שהושג מהמעבדה Ausubel). irg-1 ידוע להיות חריפה המושרה במעי של בעלי חיים נגועים בשלב מוקדם של זיהום על ידי aeruginosa פ PA14. 16 , 17 איור 2 B מציג זמן לשגות תמונות של תולעת נציג (אותה חיה כמו איור 2א). כל תמונה פלורסצנטיות נלקח מיד לאחר התמונה בהיר-השדה המתאים. בהזיהום הראשון פוסט 5 שעות, זריחה GFP מגדילה רק במתינות ב אמצע הגוף והזנב. לאחר מכן, עלייה משמעותית קרינה פלואורסצנטית הוא ציין, החל מאמצע הגוף. קרינה פלואורסצנטית הכולל של כל תולעת מותווים איור 2C כפונקציה של הזמן שלאחר זיהום. נתונים אלה ממחישים את תנאי הגיוס שתואר קודם לכן irg-1 על זיהום PA14 אלא גם מידת ההשתנות תולעת לתולעת ב העיתוי וההיקף של אינדוקציה.
העיצוב של המכשיר microfluidic WormSpa כולל מסננים לאסוף את הביצים על-ידי כל תולעת5. ברגע בוקעות, הזחלים L1 נשטפים דרך המסנן, לתוך הצינור לשקע. זה אפשר לנו לעקוב באופן ידני את כנס קינטיקה של תולעים בודדים במהלך זיהום חיידקי. זמן לשגות תמונות של הביצים שמטילים את התולעת זהה כמו באיור 2 מוצגים באיור 3א. התמונות האלו צולמו נכון אחרי התמונות בהיר-שדה המתאים באיור 2א. המספר המצטבר של ביצים על-ידי כל תולעת מוצג כפונקציה של הזמן זיהום פוסט איור 3B, ממוצע, סטיית תקן על כלל האוכלוסייה מוצגות באיור איור 3ג'. נתונים אלה ללכוד ההשתנות בעלי חיים-אל-חיה, כמו גם הירידה שתואר קודם לכן להטלת ביצים התקדמות הזיהום. לעומת זאת, אצל בעלי חיים נגוע שיעור להטלת ביצים לא תפחת עד שהוא מגיע לשיאו בשעות ~ 54 פוסט L1 בגיל 25 ° C5,18.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57348/57348fig1.jpg"> איור 1: ערכת ניסיוני של הדמיה חיה של תולעים במכשיר microfluidic. תולעים מוטענים לתוך המכשיר דרך כניסת תולעתולאחר מכן יידחפו לתוך ערוצים נפרדים. ההשעיה חיידקי מוזרק לתוך המכשיר של כניסת מאגר על ידי משאבה מכנית רכוב על תפקודי לב / נשימה. המאגר יוצא דרך שקע הנמל של המכשיר. מזרקים ארבע (S1, S2/S5, S3 ו- S4) משמשים להפעלת המכשיר. קווים מקווקווים אדום הם מזרק צינורות חיבור מזרקים ואת ההתקן. <a href="https://cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57348/57348fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57348/57348fig2.jpg"> איור 2: קינטיקה ביטוי גנים נציג. זמן לשגות תמונות של תולעת נציג נלקח על ידי מיקרוסקופ פלורסצנטיות GFP שדה בהיר (א) ו- (ב) . הדימויים הימנית צולמו לפני המחלה הוצג, ואילו התמונות הימניות צולמו 10 שעות פוסט זיהום על ידי PA14. מרווח הזמן בין התמונות הוא שעה. (ג) מסלול הזמן הכולל irg-1:: זריחה GFP ב- worms בודדים. כל שורה מקבילה חיים בודד. שורות היו מיון בסדר יורד של זריחה מרושע. עוצמת קרינה פלואורסצנטית מקודדות לפי צבעים, קנה המידה של צבע מוצגת בצד הימין. <a href="https://cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57348/57348fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57348/57348fig3.jpg"> איור 3: נציג קינטיקה להטלת ביצים. (א) זמן לשגות תמונות של מספר ביצים שמטילים את התולעת זהה שמוצג באיור 2A ו- B. הדימויים הימנית צולמו לפני המחלה הוצג, ואילו התמונות הימניות צולמו 10 שעות פוסט זיהום על ידי PA14. מרווח הזמן בין התמונות הוא שעה. (B) מסלול הזמן של מספר מצטבר של ביצי תולעים בודדים. כל שורה מקבילה חיים בודד. שורות היו מיון יורד של המספר הכולל של ביצים זיון לכל תולעת. מספר הביצים מקודדות לפי צבעים, קנה המידה של צבע מוצגת בצד הימין. (ג) המספר הממוצע של ביצים הניח לכל תולעת כפונקציה של הזמן. האזור האפור מציין ± סטיית תקן אחת. <a href="https://cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57348/57348fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Supplementary Material 1" src="/files/ftp_upload/57348/57348supfig.jpg"> 1 חומר משלים: קובץ script לדוגמה אשר יוצר קובץ טקסט המכיל את העמדות הדמיה עבור כל הערוצים במכשיר WormSpa. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57348/Supp1.EditZeissTiles.m" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.</a>

Watch this Scientific Journal Video about A Microfluidic Platform for Longitudinal Imaging in Caenorhabditis elegans at JoVE.com

A Microfluidic Platform for Longitudinal Imaging in Caenorhabditis elegans

פלטפורמה Microfluidic הדמיה האורך ב Caenorhabditis elegans

במאמר זה נדגים הדמיה חיה של תולעים בודדים העסקת התקן מותאם אישית microfluidic. את ההתקן, תולעים מרובים נכלאים בנפרד כדי להפריד בין תאי, ומאפשר מעקב מרובבת האורך של תהליכים ביולוגיים שונים.

In the last decade, microfluidic techniques have been applied to study small animals, including the nematode Caenorhabditis elegans, and have proved ...

a-microfluidic-platform-for-longitudinal-imaging-caenorhabditis

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Bioengineering

A Microfluidic Platform for Longitudinal Imaging in Caenorhabditis elegans

6.4K Views.  Kongju National University. במאמר זה נדגים הדמיה חיה של תולעים בודדים העסקת התקן מותאם אישית microfluidic. את ההתקן, תולעים מרובים נכלאים בנפרד כדי להפריד בין תאי, ומאפשר מעקב מרובבת האורך של תהליכים ביולוגיים שונים.

Video: A Microfluidic Platform for Longitudinal Imaging in Caenorhabditis elegans

Simple Microfluidic Devices for in vivo Imaging of C. elegans, Drosophila and Zebrafish

Micro fabricated fluidic devices provide an accessible micro-environment for in vivo studies on small organisms. Simple fabrication processes are available for microfluidic devices using soft lithography techniques 1-3. Microfluidic devices have been used for sub-cellular imaging 4,5, in vivo laser microsurgery 2,6 and cellular imaging 4,7. In vivo imaging requires immobilization of organisms. This has been achieved using suction 5,8, tapered channels 6,7,9, deformable membranes 2-4,10, suction with additional cooling 5, anesthetic gas 11, temperature sensitive gels 12, cyanoacrylate glue 13 and anesthetics such as levamisole 14,15. Commonly used anesthetics influence synaptic transmission 16,17 and are known to have detrimental effects on sub-cellular neuronal transport 4. In this study we demonstrate a membrane based poly-dimethyl-siloxane (PDMS) device that allows anesthetic free immobilization of intact genetic model organisms such as Caenorhabditis elegans (C. elegans), Drosophila larvae and zebrafish larvae. These model organisms are suitable for in vivo studies in microfluidic devices because of their small diameters and optically transparent or translucent bodies. Body diameters range from ~10 &mu;m to ~800 &mu;m for early larval stages of C. elegans and zebrafish larvae and require microfluidic devices of different sizes to achieve complete immobilization for high resolution time-lapse imaging. These organisms are immobilized using pressure applied by compressed nitrogen gas through a liquid column and imaged using an inverted microscope. Animals released from the trap return to normal locomotion within 10 min.
We demonstrate four applications of time-lapse imaging in C. elegans namely, imaging mitochondrial transport in neurons, pre-synaptic vesicle transport in a transport-defective mutant, glutamate receptor transport and Q neuroblast cell division. Data obtained from such movies show that microfluidic immobilization is a useful and accurate means of acquiring in vivo data of cellular and sub-cellular events when compared to anesthetized animals (Figure 1J and 3C-F 4).
Device dimensions were altered to allow time-lapse imaging of different stages of C. elegans, first instar Drosophila larvae and zebrafish larvae. Transport of vesicles marked with synaptotagmin tagged with GFP (syt.eGFP) in sensory neurons shows directed motion of synaptic vesicle markers expressed in cholinergic sensory neurons in intact first instar Drosophila larvae. A similar device has been used to carry out time-lapse imaging of heartbeat in ~30 hr post fertilization (hpf) zebrafish larvae. These data show that the simple devices we have developed can be applied to a variety of model systems to study several cell biological and developmental phenomena in vivo.

Simple Microfluidic Devices for in vivo Imaging of C. elegans, Drosophila and Zebrafish

A simple microfluidic device has been developed to perform anesthetic free in vivo imaging of C. elegans, intact Drosophila larvae and zebrafish larvae. The device utilizes a deformable PDMS membrane to immobilize these model organisms in order to perform time lapse imaging of numerous processes such as heart beat, cell division and sub-cellular neuronal transport. We demonstrate the use of this device and show examples of different types of data collected from different model systems.

התקני microfluidic פשוטים עבור<em&gt; In vivo</em&gt; הדמיה של<em&gt; ג elegans</em&gt;,<em&gt; דרוזופילה</em&gt; ודג זברה

Micro fabricated fluidic devices provide an accessible micro-environment for in vivo studies on small organisms. Simple fabrication processes are ...

High-throughput Protein Expression Generator Using a Microfluidic Platform

Rapidly increasing fields, such as systems biology, require the development and implementation of new technologies, enabling high-throughput and high-fidelity measurements of large systems. Microfluidics promises to fulfill many of these requirements, such as performing high-throughput screening experiments on-chip, encompassing biochemical, biophysical, and cell-based assays1. Since the early days of microfluidics devices, this field has drastically evolved, leading to the development of microfluidic large-scale integration2,3. This technology allows for the integration of thousands of micromechanical valves on a single device with a postage-sized footprint (Figure 1). We have developed a high-throughput microfluidic platform for generating in vitro expression of protein arrays (Figure 2) named PING (Protein Interaction Network Generator). These arrays can serve as a template for many experiments such as protein-protein 4, protein-RNA5 or protein-DNA6 interactions.
The device consist of thousands of reaction chambers, which are individually programmed using a microarrayer. Aligning of these printed microarrays to microfluidics devices programs each chamber with a single spot eliminating potential contamination or cross-reactivity Moreover, generating microarrays using standard microarray spotting techniques is also very modular, allowing for the arraying of proteins7, DNA8, small molecules, and even colloidal suspensions. The potential impact of microfluidics on biological sciences is significant. A number of microfluidics based assays have already provided novel insights into the structure and function of biological systems, and the field of microfluidics will continue to impact biology.

We present a microfluidic approach for the expression of protein arrays. The device consists of thousands of reaction chambers controlled by micro-mechanical valves. The microfluidic device is mated to a microarray-printed gene library. These genes are then transcribed and translated on-chip, resulting in a protein array ready for experimental use.

גנרטור ביטוי חלבון תפוקה גבוהה באמצעות פלטפורמת Microfluidic

Rapidly increasing fields, such as systems biology, require the development and implementation of new technologies, enabling high-throughput and ...

Microfluidic-based Electrotaxis for On-demand Quantitative Analysis of Caenorhabditis elegans' Locomotion

The nematode Caenorhabditis elegans is a versatile model organism for biomedical research because of its conservation of disease-related genes and pathways as well as its ease of cultivation. Several C. elegans disease models have been reported, including neurodegenerative disorders such as Parkinson's disease (PD), which involves the degeneration of dopaminergic (DA) neurons 1. Both transgenes and neurotoxic chemicals have been used to induce DA neurodegeneration and consequent movement defects in worms, allowing for investigations into the basis of neurodegeneration and screens for neuroprotective genes and compounds 2,3.
Screens in lower eukaryotes like C. elegans provide an efficient and economical means to identify compounds and genes affecting neuronal signaling. Conventional screens are typically performed manually and scored by visual inspection; consequently, they are time-consuming and prone to human errors. Additionally, most focus on cellular level analysis while ignoring locomotion, which is an especially important parameter for movement disorders.
We have developed a novel microfluidic screening system (Figure 1) that controls and quantifies C. elegans' locomotion using electric field stimuli inside microchannels. We have shown that a Direct Current (DC) field can robustly induce on-demand locomotion towards the cathode ("electrotaxis") 4. Reversing the field's polarity causes the worm to quickly reverse its direction as well. We have also shown that defects in dopaminergic and other sensory neurons alter the swimming response 5. Therefore, abnormalities in neuronal signaling can be determined using locomotion as a read-out. The movement response can be accurately quantified using a range of parameters such as swimming speed, body bending frequency and reversal time.
Our work has revealed that the electrotactic response varies with age. Specifically, young adults respond to a lower range of electric fields and move faster compared to larvae 4. These findings led us to design a new microfluidic device to passively sort worms by age and phenotype 6.
We have also tested the response of worms to pulsed DC and Alternating Current (AC) electric fields. Pulsed DC fields of various duty cycles effectively generated electrotaxis in both C. elegans and its cousin C. briggsae 7. In another experiment, symmetrical AC fields with frequencies ranging from 1 Hz to 3 KHz immobilized worms inside the channel 8.
Implementation of the electric field in a microfluidic environment enables rapid and automated execution of the electrotaxis assay. This approach promises to facilitate high-throughput genetic and chemical screens for factors affecting neuronal function and viability.

Microfluidic-based Electrotaxis for On-demand Quantitative Analysis of Caenorhabditis elegans' Locomotion

A semi-automated micro-electro-fluidic method to induce on-demand locomotion in Caenorhabditis elegans is described. This method is based on the neurophysiologic phenomenon of worms responding to mild electric fields (&#x201C;electrotaxis&#x201D;) inside microfluidic channels. Microfluidic electrotaxis serves as a rapid, sensitive, low-cost, and scalable technique to screen for factors affecting neuronal health.

Electrotaxis מבוסס microfluidic לניתוח כמותי על פי דרישה של<em&gt; Elegans Caenorhabditis</em&gt; &#39;נידות

The nematode Caenorhabditis elegans is a versatile model organism for biomedical research because of its conservation of disease-related genes and ...

Cell Squeezing as a Robust, Microfluidic Intracellular Delivery Platform

Rapid mechanical deformation of cells has emerged as a promising, vector-free method for intracellular delivery of macromolecules and nanomaterials. This technology has shown potential in addressing previously challenging applications; including, delivery to primary immune cells, cell reprogramming, carbon nanotube, and quantum dot delivery. This vector-free microfluidic platform relies on mechanical disruption of the cell membrane to facilitate cytosolic delivery of the target material. Herein, we describe the detailed method of use for these microfluidic devices including, device assembly, cell preparation, and system operation. This delivery approach requires a brief optimization of device type and operating conditions for previously unreported applications. The provided instructions are generalizable to most cell types and delivery materials as this system does not require specialized buffers or chemical modification/conjugation steps. This work also provides recommendations on how to improve device performance and trouble-shoot potential issues related to clogging, low delivery efficiencies, and cell viability.

Rapid mechanical deformation of cells has emerged as a promising, vector-free method for intracellular delivery of macromolecules and nanomaterials. This protocol provides detailed steps on how to use the system for a broad range of applications.

לוחץ תא כחזק, Microfluidic תאית פלטפורמה להצגה

Rapid mechanical deformation of cells has emerged as a promising, vector-free method for intracellular delivery of macromolecules and nanomaterials. This ...

Electrotaxis Studies of Lung Cancer Cells using a Multichannel Dual-electric-field Microfluidic Chip

The behavior of directional cell migration under a direct current electric-field (dcEF) is referred to as electrotaxis. The significant role of physiological dcEF in guiding cell movement during embryo development, cell differentiation, and wound healing has been demonstrated in many studies. By applying microfluidic chips to an electrotaxis assay, the investigation process is shortened and experimental errors are minimized. In recent years, microfluidic devices made of polymeric substances (e.g., polymethylmethacrylate, PMMA, or acrylic) or polydimethylsiloxane (PDMS) have been widely used in studying the responses of cells to electrical stimulation. However, unlike the numerous steps required to fabricate a PDMS device, the simple and rapid construction of the acrylic micro&#64258;uidic chip makes it suitable for both device prototyping and production. Yet none of the reported devices facilitate the efficient study of the simultaneous chemical and dcEF effects on cells. In this report, we describe our design and fabrication of an acrylic-based multichannel dual-electric-field (MDF) chip to investigate the concurrent effect of chemical and electrical stimulation on lung cancer cells. The MDF chip provides eight combinations of electrical/chemical stimulations in a single test. The chip not only greatly shortens the required experimental time but also increases accuracy in electrotaxis studies.

Many microfluidic devices have been developed for use in the study of electrotaxis. Yet, none of these chips allows the efficient study of the simultaneous chemical and electric-field (EF) effects on cells. We developed a polymethylmethacrylate-based device that offers better-controlled coexisting EF and chemical stimulation for use in electrotaxis research.

Electrotaxis מחקרים של תאי סרטן ריאות באמצעות רב-ערוצי דו-חשמלי-שדה שבב microfluidic

The behavior of directional cell migration under a direct current electric-field (dcEF) is referred to as electrotaxis. The significant role of ...

A Microfluidic Platform for High-throughput Single-cell Isolation and Culture

Studying the heterogeneity of single cells is crucial for many biological questions, but is technically difficult. Thus, there is a need for a simple, yet high-throughput, method to perform single-cell culture experiments. Here, we report a microfluidic chip-based strategy for high-efficiency single-cell isolation (~77%) and demonstrate its capability of performing long-term single-cell culture (up to 7 d) and cellular heterogeneity analysis using clonogenic assay. These applications were demonstrated with KT98 mouse neural stem cells, and A549 and MDA-MB-435 human cancer cells. High single-cell isolation efficiency and long-term culture capability are achieved by using different sizes of microwells on the top and bottom of the microfluidic channel. The small microwell array is designed for precisely isolating single-cells, and the large microwell array is used for single-cell clonal culture in the microfluidic chip. This microfluidic platform constitutes an attractive approach for single-cell culture applications, due to its flexibility of adjustable cell culture spaces for different culture strategies, without decreasing isolation efficiency.

Here, we present a protocol for isolating and culturing single cells with a microfluidic platform, which utilizes a new microwell design concept to allow for high-efficiency single cell isolation and long-term clonal culture.

פלטפורמת Microfluidic עבור בידוד תפוקה גבוהה מתא בודד ותרבות

Studying the heterogeneity of single cells is crucial for many biological questions, but is technically difficult. Thus, there is a need for a simple, yet ...

Microfluidic Platform with Multiplexed Electronic Detection for Spatial Tracking of Particles

Microfluidic processing of biological samples typically involves differential manipulations of suspended particles under various force fields in order to spatially fractionate the sample based on a biological property of interest. For the resultant spatial distribution to be used as the assay readout, microfluidic devices are often subjected to microscopic analysis requiring complex instrumentation with higher cost and reduced portability. To address this limitation, we have developed an integrated electronic sensing technology for multiplexed detection of particles at different locations on a microfluidic chip. Our technology, called Microfluidic CODES, combines Resistive Pulse Sensing with Code Division Multiple Access to compress 2D spatial information into a 1D electrical signal. In this paper, we present a practical demonstration of the Microfluidic CODES technology to detect and size cultured cancer cells distributed over multiple microfluidic channels. As validated by the high-speed microscopy, our technology can accurately analyze dense cell populations all electronically without the need for an external instrument. As such, the Microfluidic CODES can potentially enable low-cost integrated lab-on-a-chip devices that are well suited for the point-of-care testing of biological samples.

We demonstrate a microfluidic platform with an integrated surface electrode network that combines resistive pulse sensing (RPS) with code division multiple access (CDMA), to multiplex detection and sizing of particles in multiple microfluidic channels.

פלטפורמת microfluidic עם איתור Multiplexed אלקטרוני למערכות מעקב מרחבית של חלקיקים

Microfluidic processing of biological samples typically involves differential manipulations of suspended particles under various force fields in order to ...

Imaging the Root Hair Morphology of Arabidopsis Seedlings in a Two-layer Microfluidic Platform

Root hairs increase root surface area for better water uptake and nutrient absorption by the plant. Because they are small in size and often obscured by their natural environment, root hair morphology and function are difficult to study and often excluded from plant research. In recent years, microfluidic platforms have offered a way to visualize root systems at high resolution without disturbing the roots during transfer to an imaging system. The microfluidic platform presented here builds on previous plant-on-a-chip research by incorporating a two-layer device to confine the Arabidopsis thaliana main root to the same optical plane as the root hairs. This design enables the quantification of root hairs on a cellular and organelle level and also prevents z-axis drifting during the addition of experimental treatments. We describe how to store the devices in a contained and hydrated environment, without the need for fluidic pumps, while maintaining a gnotobiotic environment for the seedling. After the optical imaging experiment, the device may be disassembled and used as a substrate for atomic force or scanning electron microscopy while keeping fine root structures intact.

Imaging the Root Hair Morphology of Arabidopsis Seedlings in a Two-layer Microfluidic Platform

This article demonstrates how to culture Arabidopsis thaliana seedlings in a two-layer microfluidic platform that confines the main root and root hairs to a single optical plane. This platform can be used for real-time optical imaging of fine root morphology as well as for high-resolution imaging by other means.

הדמיה המורפולוגיה שורש השיער של תודרנית השתילים בשטח פלטפורמה Microfluidic דו שכבתי

Root hairs increase root surface area for better water uptake and nutrient absorption by the plant. Because they are small in size and often obscured by ...

An Ultrahigh-throughput Microfluidic Platform for Single-cell Genome Sequencing

Sequencing technologies have undergone a paradigm shift from bulk to single-cell resolution in response to an evolving understanding of the role of cellular heterogeneity in biological systems. However, single-cell sequencing of large populations has been hampered by limitations in processing genomes for sequencing. In this paper, we describe a method for single-cell genome sequencing (SiC-seq) which uses droplet microfluidics to isolate, amplify, and barcode the genomes of single cells. Cell encapsulation in microgels allows the compartmentalized purification and tagmentation of DNA, while a microfluidic merger efficiently pairs each genome with a unique single-cell oligonucleotide barcode, allowing &gt;50,000 single cells to be sequenced per run. The sequencing data is demultiplexed by barcode, generating groups of reads originating from single cells. As a high-throughput and low-bias method of single-cell sequencing, SiC-seq will enable a broader range of genomic studies targeted at diverse cell populations.

Single-cell sequencing reveals genotypic heterogeneity in biological systems, but current technologies lack the throughput necessary for the deep profiling of community composition and function. Here, we describe a microfluidic workflow for sequencing &gt;50,000 single-cell genomes from diverse cell populations.

פלטפורמת Microfluidic על קוליים בתפוקה של רצף הגנום בתא יחיד

Sequencing technologies have undergone a paradigm shift from bulk to single-cell resolution in response to an evolving understanding of the role of ...

Immobilization of Live Caenorhabditis elegans Individuals Using an Ultra-thin Polydimethylsiloxane Microfluidic Chip with Water Retention

Radiation is widely used for biological applications and for ion-beam breeding, and among these methods, microbeam irradiation represents a powerful means of identifying radiosensitive sites in living organisms. This paper describes a series of on-chip immobilization methods developed for the targeted microbeam irradiation of live individuals of Caenorhabditis elegans. Notably, the treatment of the polydimethylsiloxane (PDMS) microfluidic chips that we previously developed to immobilize C. elegans individuals without the need for anesthesia is explained in detail. This chip, referred to as a worm sheet, is resilient to allow the microfluidic channels to be expanded, and the elasticity allows animals to be enveloped gently. Also, owing to the self-adsorption capacity of the PDMS, animals can be sealed in the channels by covering the surface of the worm sheet with a thin cover film, in which animals are not pushed into the channels for enclosure. By turning the cover film over, we can easily collect the animals. Furthermore, the worm sheet shows water retention and allows C. elegans individuals to be subjected to microscopic observation for long periods under live conditions. In addition, the sheet is only 300 &#181;m thick, allowing heavy ions such as carbon ions to pass through the sheet enclosing the animals, thus allowing the ion particles to be detected and the applied radiation dose to be measured accurately. Because selection of the cover films used for enclosing the animals is very important for successful long-term immobilization, we conducted the selection of the suitable cover films and showed a recommended one among some films. As an application example of the chip, we introduced imaging observation of muscular activities of animals enclosing the microfluidic channel of the worm sheet, as well as the microbeam irradiation. These examples indicate that the worm sheets have greatly expanded the possibilities for biological experiments.

Immobilization of Live Caenorhabditis elegans Individuals Using an Ultra-thin Polydimethylsiloxane Microfluidic Chip with Water Retention

A series of immobilization methods has been established to allow the targeted irradiation of live Caenorhabditis elegans individuals using a recently developed ultra-thin polydimethylsiloxane microfluidic chip with water retention. This novel on-chip immobilization is also adequate for imaging observations. The detailed treatment and application examples of the chip are explained.

קיבעון של אנשים חיים Caenorhabditis elegans באמצעות שבב Microfluidic של דקים ועומדים בטמפרטורות Polydimethylsiloxane עם החזקת מים

Radiation is widely used for biological applications and for ion-beam breeding, and among these methods, microbeam irradiation represents a powerful means ...