פרוטוקול זה עשוי להיות שימושי לטיפול בשאלות על תפקידם של מקלעות choroid ותאי חיסון היקפיים בוויסות המוח בהקשרים שונים במודלים עכבר. פרוטוקול זה מאפשר ניתוח כמותי ואיכותי מעמיק של אוכלוסיות תאי החיסון הייחודיות בקליעות הכורואידיות של עכברים. ניתוח של מקלעות choroid יכול להיות קשה בהתחלה בשל גודלם הקטן וצבע שקוף.
אנו ממליצים לתרגל תחילה על בעלי חיים שאינם מנוטרלים. כדי להתחיל, למקם את המוח מנותח מן C57 שחור שישה עכבר גב צד למעלה בצלחת פטרי ומניחים את המנה מתחת למטרות של לולאות משקפת. תוך שמירה על המוח במקום באמצעות מלקחיים, הכנס את שני הקצוות של זוג מלקחיים אחרים למטה דרך קו האמצע בין ההמיספרות.
באמצעות המלקחיים, למשוך את קליפת המוח עם callosum והיפוקמפוס מן המחיצה, חשיפת החדר לרוחב וחלק החדר השלישי. זהה את מקלעת הכורואידים לרוחב כהינומה ארוכה המצפה את החדר לרוחב ומתלקח בשני קצותיו. לאחר מכן באמצעות שני קצוות של מלקחיים דקים, לאסוף את מקלעת choroid לרוחב.
היזהר לאסוף את החלק האחורי המשולש מוסתר על ידי הקיפול האחורי של ההיפוקמפוס. לאחר מכן, משוך את קליפת המוח עם קורפוס קאלוזום והיפוקמפוס של חצי הכדור הנגדי הרחק מהמחיצה כדי לחשוף את כל החדר השלישי ואת החדר הצדדי ההפוך. באמצעות מלקחיים עדינים, לאסוף את מקלעת choroid השלישי מזוהה כמבנה קצר עם היבט משטח פרטני.
ואז לאסוף את מקלעת choroid לרוחב האחר. לאחר מכן, הכנס את שני הקצוות של המלקחיים למטה בין המוח הקטן לבין המוח האמצעי וניתק את המוח הקטן מן הפונס ואת medulla כדי לחשוף את החדר הרביעי. לאחר מכן זהה את מקלעת הכורואיד הרביעית כמבנה כדורי ארוך עם היבט משטח פרטני המרפד את החדר הרביעי מהקצה הימני לרוחב לקצה השמאלי בין המוח הקטן למדולה.
באמצעות מלקחיים עדינים, לאסוף את מקלעת choroid הרביעי. לאחר הדגירה של כל מקלעות הכורואידים שנאספו עם קולגנאז 4, פיפטה עדינה למעלה ולמטה סביב 10 פעמים כדי לסיים את הניתוק. לאחר מכן מלאו את הצינור ל-1.5 מיליליטר עם מאגר MACS כדי לעצור את פעילות הקולגנאז הרביעי.
לאחר מכן, צנטריפוגה התאים להשליך את supernatant לפני שטיפת התאים עם 1.5 מיליליטר של מאגר MACS. לאחר הוספת חרוזי פיצוי מתאימים ופתרונות נוגדנים, לדגור על הדגימות על קרח במשך 30 עד 45 דקות, להגן עליהם מפני חשיפה לאור. לאחר מכן מלא את הצינורות עם 1.5 מיליליטר של מאגר MACS וצנטריפוגה התאים וחרוזי פיצוי.
לאחר שימוש חוזר בתאים וחרוזי פיצוי ב 500 מיקרוליטרים של מאגר MACS, לסנן את התאים באמצעות מסננת 70 מיקרון. לאחר הפעלת cytometer הזרימה ואת התוכנה, בחר אזור פיזור קדימה לעומת אזור פיזור בצד ושער עבור תאים המבוססים על גודל. לאחר מכן צור שער בת עבור תאים בודדים עם אזור פיזור קדימה לעומת גובה פיזור קדימה.
לאחר מכן, צור שער בת עבור תאים חיים עם DAPI לעומת אזור פיזור קדימה כדי לא לכלול את התאים החיוביים של DAPI. לאחר מכן צור שער בת עבור תאי מערכת החיסון החיוביים CD45 עם CD45 לעומת אזור פיזור קדימה. כעת, צור שער בת מהתאים החיוביים CD45 ובחר F480 לעומת CD11b כדי לזהות את ה- CD11b חיובי F480 חיובי ואת האוכלוסיות השליליות החיוביות של CD11b F480.
לאחר מכן צור שער בת עבור תאים חיוביים מסוג CD11b F480 ובחר CX3CR1 לעומת IA-IE כדי לזהות הן את המקרופאגים החיוביים של CX3CR1 הקשורים לגבול IA-IE והן את המקרופאגים השליליים החיוביים של IA-IE של CX3CR1. לאחר מכן, צור שער בת עבור CD11b חיובי F480 חיובי CX3CR1 חיובי CX3CR1 מקרופאגים שליליים IA-IE ובחר F480 לעומת CD11b כדי לזהות הן CD11b גבוה F480 בינוני CX3CR1 חיובי CX3CR1 חיובי IA-IE של מקרופאגים אפילקסוס שליליים של קולמר ו CD11b חיובי F480 F480 גבוה CX3CR1 חיובי IA-IE מאקרופגים הקשורים לגבול. ואז מהאוכלוסייה השלילית F480 החיובית CD11b, שער עבור Ly6C לעומת IA-IE.
בחר הן אוכלוסיה שלילית חיובית של IA-IE Ly6C והן תאים חיוביים שליליים של IA-IE Ly6C המתאימים בעיקר למונוציטים או לנויטרופילים. לבסוף, צור שער בת עבור CD11b חיובי F480 שלילי IA-IE שלילי IA-IE חיובי Ly6C אוכלוסייה שלילית ובחר CD11b לעומת CX3CR1. לאחר מכן זהה הן אוכלוסיות שליליות CX3CR1 גבוהות של CD11b והן אוכלוסיות שליליות חיוביות של CD11b CX3CR1.
עבור Gating תאי T, לאחר אי הכללת התאים החיוביים של DAPI כמתואר לעיל, צור שער בת עבור תאי מערכת החיסון החיוביים CD45 עם CD45 לעומת FSC-A, ולאחר מכן צור שער בת מהתאים החיוביים CD45 ובחר TCR beta לעומת CD11b. אל תכלול את תאי המיאלואיד החיוביים CD11b ובחר באוכלוסיית תאי T-Cell T שלילית של CD11b. לבסוף, צור שער בת עבור האוכלוסייה השלילית CD11b חיובית של TCR beta ובחר CD4 לעומת CD8a.
זהה הן תאי T שליליים והן תאי T חיוביים ל- CD8 ו- CD4 חיובי CD8 ותאי T שליליים CD4 חיוביים ל- CD8. ניתוחי ציטומטריית הזרימה שהודגמו כאן חשפו בהצלחה תת-קבוצות עיקריות של תאי מיאלואיד ו-T ומספרם הכולל היחסי לעכבר באופן רב לשחזור. ניתוח ציטומטריה זרימה של התאים המיאלואידיים מראה כי מקלעת choroid מאוכלסת על ידי CD11b חיובי CX3CR1 F480 חיובי F480 מקרופאגים הקשורים לגבול גבוה, המייצג 80% של CD45 תאי מערכת החיסון החיובית בקליעת choroid.
זוהתה גם האוכלוסייה השלילית החיובית של ה-IA-IE של מקרופאגים האפילקסוס של קולמר. בקרב תאי החיסון השליליים F480 החיוביים של CD11b, התאפיינו שתי אוכלוסיות שונות של תאי IA-IE שליליים של Ly6C וסביר להניח שיתאימו לתאים דנדריטיים. אסטרטגיית הניתוח וההתהוות של תאי T הדגישה את נוכחותה של האוכלוסייה הקטנה של CD45 חיובי CD11b תאי בטא חיוביים TCR שליליים.
ביניהם, על 30-50 CD8 CD8 שלילי CD4 חיובי CD4 CD4 חיובי CD4 תאי T שליליים לכל עכבר אכלס את מקלעת choroid בתנאים פיזיולוגיים. חשוב לשלוט על איכות הזלוף מאז כל זיהום דם עלול לטשטש את ההרכב החיסוני של מקלעת choroid. שיטה זו יכולה להיות מלווה על-ידי מיון של אוכלוסיות תאים נבחרות לניתוח נוסף כגון רצף RNA בצובר או תא יחיד.
