פרוטוקול זה משמעותי מכיוון שהוא מאפשר לזהות את האינטראקציה בין הצמח לפטריה. בנוסף לצביעת הפקטין, הוא גם מדגים פגמים בפולימר דופן תא הפתוגן ומאפשר זיהוי של מבני פטריות. טכניקה פשוטה ולא מסובכת זו יכולה להתבצע באמצעות מיקרוסקופ אור והיא אינה דורשת ציוד יקר כגון מיקרוסקופ אלקטרונים סורק.
בנוסף, זוהי טכניקה מהירה המקבלת הבחנה מצוינת של מבני צמחים למחקרים היסטופתולוגיים. הטכניקה מזהה את האינטראקציה בין צמח לפטריה. לפיכך, הוא משתף פעולה כדי לאבחן את המחלות הנגרמות על ידי פטריות ביוטרופיות ונקרוטרופיות כגון חלודה קפה וסרקוספוריוזיס.
כדי להתחיל, לקצור כ 10 מילימטר מרובע עלה דגימה באזור האמצעי של הנגע באמצעות אזמל פינצטה, ולטבול אותו 30 מיליליטר של תמיסה מקבעת Karnovsky. הכפיפו את דגימת העלה לוואקום נמוך של 500 עד 600 מילבר למשך 15 דקות באמצעות משאבת שמן, לפחות פי ארבעה כדי להגדיל את החדירות של התמיסה המקבעת ברקמת העלה. לאחר הקיבוע, שטפו את דגימת העלים שלוש פעמים ב-0.5 מ' חיץ קקודילט מדולל במים מזוקקים במשך חמש דקות כל אחת, ולאחר מכן העבירו אותה לסדרה אתנולית מדורגת למשך 15 דקות בכל ריכוז אתנול.
כדי להעביר בהדרגה את הדגימות לגליקול מתקרילט, צרו את תמיסה A על ידי ערבוב גרם אחד של אבקת גליקול מתקרילט עם 100 מיליליטרים של שרף בסיסי תחת תסיסה מגנטית. לאחר מכן, טבלו את הדגימות ביחס אחד עד שניים של פתרון A ו-100% אתנול למשך שלוש שעות. טבלו את הדגימות ביחס אחד לאחד עבור פתרון A:100%אתנול למשך שלוש שעות, ולאחר מכן שקעו בשרף בסיסי טהור למשך יומיים עד ארבעה ימים.
הכפיפו את הדגימה לשואב ואקום נמוך לפחות ארבע פעמים ביום למשך 15 דקות, ולאחר מכן סיבוב. יש לערבב 15 מיליליטרים של תמיסה A עם מיליליטר אחד של המתקשה בכוס עם סיבוב במשך שתי דקות כדי לייצר את פתרון הפילמור B.Put 1.2 מיליליטרים של פתרון פילמור זה B בתבניות פלסטיק. באמצעות פיק עץ, העבירו את דגימות העלים הנגעים משרף בסיסי טהור לפתרון B והימנעו משימוש בפינצטה מכיוון שהן עלולות לגרום לריסוק רקמות.
הקפידו לכוון במהירות דגימות עלים בניצב לתבניות הפלסטיק מכיוון שפתרון B הופך במהירות לצמיג. כאשר הכיוון הניצב של דגימות העלים מושג, יש להמתין 30 דקות ולאחר מכן להעביר את תבנית הפלסטיק לתא פלסטיק או זכוכית המכיל ג'ל סיליקה כדי למנוע לחות. לאחר שהשרף ודגימת העלים עוברים פולימר לאחר שעתיים עד שלוש שעות, נתקו את הגוש שנוצר מתבנית הפלסטיק על ידי שיוף בסיס הבלוק בקובץ שיוף.
לאחר מכן, הדביקו את הבלוק לחתיכת עץ. חותכים את הבלוק לחמישה חלקים בעובי מיקרומטר באמצעות מיקרוטום מסתובב המצויד בלהבי פלדה בקוטר שמונה סנטימטרים. הניחו את החלקים על מגלשות זכוכית מכוסות במים מזוקקים.
לאחר מכן, העבירו את המגלשות לצלחת חמה כדי להתייבש בטמפרטורה של 40 מעלות צלזיוס וקדמו את ההדבקה של החלקים לשקופיות הזכוכית. לאחר הייבוש, סמן את שקופיות הזכוכית בשם הפניה לבלוק ובמספר השקופית. מכסים את החלקים בשני מיליליטרים של 5% כותנה כחולה בלקטופנול ומחממים אותם על צלחת חמה בטמפרטורה של 45 מעלות צלזיוס במשך חמש דקות.
מסירים את הצבע העודף על ידי שטיפת המגלשה שלוש פעמים בכוס מלאה במים מזוקקים. הכתימו אותו בשני מיליליטרים של 0.01%רותניום אדום במים למשך דקה אחת. מסירים את הצבע העודף על ידי שטיפת המגלשה שלוש פעמים בכוס מלאה במים מזוקקים.
הניחו טיפת מים מזוקקים על החלקים וכיסו את החלקים בהחלקת כיסוי לביצוע ניתוח מיקרוסקופיה קלה. בשיטת ההכתמה הכפולה, Hemileia vastatrix hyphae המכילה את דפנות התאים ואת תכולת הפרוטופלסטים הצפופים נראתה כחולה כהה הן בפרנכימה ספוגית והן בפרנכימה פליסיידית. תא האם של האוסטוריום וההאוזטוריה הפגינו גם הם בצבע כחול כהה.
הכתם הנגדי באדום רותניום הגדיר בבירור את ההתפלגות הפטרייתית בחללים הבין-תאיים. במהלך האינטראקציה, תא האם של Hemileia vastatrix haustorium שבר את דופן התא המארח ופיתח צוואר האוסטוריאלי מוקף בתרכובות פקטיות. אנקפסולציה עשירה בפקטין בצבע ורוד-אדום של הצוואר ההוסטוריאלי אינה יכולה למנוע היווצרות האוסטוריאלית.
במקרים מסוימים, האנקפסולציה העשירה בפקטין עטפה את האוסטוריום באופן חלקי. ובמקרים מסוימים, האוסטוריום עטוף במלואו. דופן התא העשירה בפקטין שומרת על שלמות גבול הנגע, שם הפטרייה אינה נוכחת.
שיטת ההכתמה הכפולה הדגימה את נוכחותם של תפרים בין-תאיים. באזורי אינטראקציה, נראה כי דפנות תאי פקטין איבדו את שלמותם עקב פירוק. מבני רבייה כגון קונידיה נמצאו באפידרמיס הא-אקסיאלי.
Cercospora coffeicola hyphae נמצאו בתא התת-סטומי כמבנים מסתלסלים, ונראה כי הפרנכימה הפליסיידית באזור הנגע עוברת ליזיס של דופן התא. הימנע משימוש בפינצטה מכיוון שהם עלולים לגרום לריסוק רקמות. מחקרים היסטופתולוגיים נוספים על חלודה, אנתרקנוז, סרקוספוריוזיס, סמוטציות ואינטראקציות ביוטרופיות, המיביוטרופיות ונקרוטרופיות אחרות בין צמחים לפטריות צריכים להתבצע כדי לחקור את השימוש הפוטנציאלי בטכניקה זו במערכות פאתוסיסטיות שונות.
