אז נגזרת חומצה נוירורמינית נמצאים רק בחיידקים פתוגניים, פלגלה אמיניגליקוזילית מכילה את הסוכר הזה. במחיקת מסגרת של האזור הכלול בגנים יכולה לסייע במציאת אשכולות גליקוזילציה של פלאגלה. טכניקה זו, האזור או הגנים הספציפיים האחרונים, כגון גליקוסילטרנספראזות שיש להן הומולוגיה גבוהה ביניהן ומעורבות בתהליכים שונים, ומנתחות את מעורבותה בתהליך הגליקוזילציה של פלגלה.
טכניקה זו יכולה גם לעזור למצוא את התפקיד של גליקוזילטרנספראזות המעורבות בביוסינתזה של פוליסכרידים רלוונטיים בחיידקים פתוגניים וגם את תפקידם של חלבוני קידוד גנים המעורבים ביצירת פלגלה. מדגים את ההליך יהיה מייט פולו, טכנאית במעבדה שלי. תכנן שני זוגות פריימרים המגבירים את אזורי הדנ"א במעלה הזרם ובמורד הזרם של הגן או האזור שנבחרו למחיקה.
פריימרים A ו-D צריכים לכלול בחמשת הקצה הראשוני, אתר הגבלה לאנדונוקלאז המאפשר שיבוט ב-pDM4. ודא שפריימרים B ו-C נמצאים בתוך הגן שיש למחוק או בתוך הגן הראשון והאחרון של האזור שיש למחוק. ודאו ששני הפריימרים נמצאים במסגרת וממוקמים בין חמישה לשישה קודונים בתוך הגן.
ודא ששני הפריימרים כוללים רצף משלים של 21 זוגות בסיסים בחמשת הקצה הראשוני כדי להצטרף לאמפליקונים של DNA AB ו- CD.השתמש ב- 100 ננוגרם של DNA כרומוזומלי מטוהר כתבנית בשתי קבוצות של PCRs אסימטריים עם פריימרים AB ו- CD ולאחר מכן ניתוח של מוצרים תוצאתיים בג'ל אגרוז 1%. לטהר ולכמת את האמפליקונים שנכרתו מג'ל אלקטרופורטי. ערבבו 100 ננוגרם של כל אמפליקון עם ריאגנטים PCR ללא פריימר.
לאחר הרחבתו, הוסיפו פריימרים A ו-D והגבירו אותם כשבר יחיד. לאחר מכן לנתח, לטהר ולכמת את המוצרים המתקבלים כפי שתואר קודם לכן. לעכל מיקרוגרם אחד של pDM4 ו-400 ננוגרם של אמפליקון AD עם אנדונוקלאז.
שלב את ה- pDM4 המעוכל עם אמפליקון AD בווקטור טוחן כדי להוסיף יחס של אחד לארבעה והכן את תגובת ההצמדה. דגירה לילה ב 20 מעלות צלזיוס. מאוחר יותר, להשבית T4 ליגאז ב 70 מעלות צלזיוס במשך 20 דקות.
חסן את Escherichia coli זן למרק לוריא ברטאני מילר ודגירה בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס עם רעד ב-200 סל"ד עד שנצפתה צפיפות אופטית בין 0.4 ל-0.6. גלול את תרבית החיידקים על ידי צנטריפוגה ב 5, 000 פעמים G ו 4 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות. מרחים את הכדור במים מזוקקים צוננים וחוזרים על תהליך הניקוי פעמיים נוספות.
מעבירים את תרחיף החיידקים לצינורות מיקרו-פוגה וחוזרים על הצנטריפוגה ב-14, 000 פעמים G ו-4 מעלות צלזיוס במשך חמש דקות. לאחר החייאה חוזרת של הכדור במים צוננים, מוסיפים כ-3.5 מיקרוליטרים של תערובת ההצמדה ודוגרים על קרח למשך חמש דקות. מעבירים את התכולה לקובט אלקטרופורציה מצונן של שני מילימטרים.
לאחר אלקטרופורציה מוסיפים את מדיום ה-SOC ומעבירים את התוכן לצינור תרבית. דגירה למשך שעה אחת ב-30 מעלות צלזיוס עם רעידות ב-200 סל"ד. צלחת את התאים שעברו טרנספורמציה על צלחות אגר LB בתוספת כלוראמפניקול.
בדוק את הכנסת מבנה המחיקה ל- pDM4 על ידי PCR באמצעות פריימרים המקיפים את צד השיבוט pDM4. הכינו תרביות לילה כך שהמקבל אירומונס זן ריפאמפיצין עמיד בפני שני זנים שונים של Escherichia coli. זן התורם עם הפלסמיד הרקומביננטי pDM4, וזן העוזר עם פלסמיד PRK 2073 ב-30 מעלות צלזיוס.
להשעות את אותו מספר מושבות של זני התורם, המקבל והעוזר בשלושה צינורות LB עם 150 מיקרוליטרים של LB. לאחר מכן על צלחת אגר LB ללא אנטיביוטיקה מערבבים את שלושת התרחיפים החיידקיים בשתי טיפות על המקבל ליחס עוזר לתורם של חמישה לאחד לאחד, ודוגרים את הצלחת עם הפנים כלפי מעלה במשך הלילה ב-30 מעלות צלזיוס. קצירת חיידקים על ידי הוספת מיליליטר אחד של ציר LB לצלחת האגר LB. מעבירים את ההשעיה החיידקית לצינור מיקרופוג' חרוטי של 1.5 מיליליטר ומערבולת נמרצת.
מפיצים 100 מיקרוליטרים של תרחיף החיידקים על צלחות אגר LB עם ריפאמפיצין וכלוראמפניקול. סובבו 200 מיקרוליטרים ו-600 מיקרוליטרים של הדגימות, השעו את הכדור ב-100 מיקרוליטרים של ציר LB וצלחת על אגר LB עם ריפאמפיצין וכלוראמפניקול ולאחר מכן הדגירה. בצע בדיקת אוקסידאז כדי לאשר שהמושבות הן אירומונס.
אשרו עוד יותר את החדרתו של פלסמיד רקומביננטי pDM4 לאזור הכרומוזומלי הספציפי על ידי PCR באמצעות פריימרים E ו- F. לגדל את המושבות הרקומביננטיות בשני מיליליטרים של LB עם 10% סוכרוז וללא אנטיביוטיקה לילה ב 30 מעלות צלזיוס. לאחר הכנת דילולים שונים של תרביות, צלחת 100 מיקרוליטרים של תרביות החיידקים ודילולים על צלחת אגר LB עם 10% סוכרוז ודגירה לילה ב 30 מעלות צלזיוס.
למחרת, לאסוף את המושבות ולהעביר אותם לצלחות LB עם ובלי כלוראמפניקול. לאחר הדגירה שלהם למשך הלילה בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס, בחרו במושבות הרגישות לכלוראמפניקול. נתחו את המושבות הרגישות באמצעות PCR באמצעות זוג פריימרים EF ובחרו את המושבות שמוצר ה-PCR שלהן תואם את גודל המבנה שנמחק.
שים טיפה קטנה של סיליקון בארבע הפינות של מגלשת הכיסוי והרכב תרבות גידול לילה של Aeromonas על מגלשת כיסוי. הניחו שקופית שנחפרה על מגלשת הכיסוי והפכו את המגלשה במהופך. נתחו את תנועתיות השחייה על ידי מיקרוסקופ אור באמצעות מיקרוסקופ אופטי, ולאחר מכן העבירו שלושה מיקרוליטרים של התרבית למרכז צלחת אגר רכה.
דוגרים את הצלחת עם הפנים כלפי מעלה בין הלילה בין 25 ל-30 מעלות צלזיוס. באמצעות סרגל בסוף הדגירה, מדוד את נדידת החיידקים ממרכז הלוחות לכיוון הפריפריה דרך האגר. תרבית אירומונס זנים בן לילה ב 900 מיליליטר TSB בין 25 ל 30 מעלות צלזיוס.
לאחר צנטריפוגה, להשעות את הכדור ב 20 מיליליטר של 100 מיליליטר טריס מימן כלורי חיץ של pH 7.8. כדי להסיר את הפלגלה המעוגנת, שחררו את המתלים במערבולת עם מוט זכוכית למשך שלוש עד ארבע דקות, ואז עברו שוב ושוב דרך מזרק 21 מדים. גלול את החיידקים על ידי שתי צנטריפוגות רצופות בארבע מעלות צלזיוס ואסוף את הסופרנטנט לתוך צינור נפרד.
לאחר ultracentrifuging את supernatant, להשעות את הכדור ב 150 microliters של 100 millimolar Tris מימן כלורי המכיל שני מילימולרי EDTA חיץ. מעבירים 150 מיקרוליטרים של החלק המועשר של פלאגלה לצינור דק ושקוף במיוחד, וממלאים אותו ב-12 מיליליטרים של תמיסת צזיום כלוריד. Ultracentrifuge את הצינור ב 60, 000 פעמים G במשך 48 שעות בארבע מעלות צלזיוס ברוטור דלי מתנדנד.
אספו את פס הפלגלה לתוך שיפוע הצזיום כלוריד עם מזרק ודיאליזה כנגד 100 מילימולאר טריס מימן כלורי בתוספת שני EDTA מילימולריים ולאחר מכן ניתוח על ידי אלקטרופורזה וכתם כחול של Coomassie או ספקטרומטריית מסה. באיור הבא, נתיב WT הוא Aeromonas piscicola AH3. נתיבים אחד עד שמונה מראים מושבות רגישות לכלוראמפניקול של הרקומבינציה השנייה.
ST הוא סמן היפר שלפוחית השתן 1KB. נתיבים אחד עד שלושה וחמישה עד שמונה מראים את המושבות עם גן FGI4 מסוג פראי כ-Lane WT. ליין ארבע מראה מושבה עם הגן FGI4 שנמחק. מבחני מיקרוסקופיית אור הראו כי שינויים בפלגלה קוטבית או לרוחבית רק מובילים להפחתה בקוטר הנדידה, ולכן, מוטציה AH-3 FGI ומוטנטים AH-3 FGI-4 מראים רק תנועתיות מופחתת ביחס לזן מסוג הבר.
האיור מראה את הפלגלום הקוטבי מ-AH-3 של נתיב 1, ואת המוטאנטים באזור ה-FGI של הגן נתיב שני ו-FGI-4 של נתיב 3, שבו לשני המוטנטים יש פלגלינים קוטביים עם משקל מולקולרי נמוך יותר מאשר לזן מסוג הבר, מה שמרמז על שינויים בפלגלה גליקאן. חשוב לוודא שמוטציות אינן משפיעות על גנים במורד הזרם ומובילות את חוסר היכולת להרכבת הפלגלה או לחוסר היכולת של חוטים של פלאגלה. כאשר שינוי בחלבוני פלאגלין אינו ניתן לזיהוי, נדרש ניתוח ספקטרומטריית מסות באמצעות החלבון הכולל של פפטידי פלאגלין כדי לדעת את מסת הגליקן.
