פרוטוקול זה מתאר בדיקה קולורימטרית בתפוקה גבוהה בשלושת שלבי מחזור החיים של טריפנוזומה קרוזי כדי לזהות מועמדים חדשים לתרופה למחלת צ'אגאס. ניתן להשתמש בו כדי לזהות תרכובות טריפנוצידיות בצורה קלה, מהירה וניתנת לשחזור. מי שתדגים את ההליך תהיה רומינה מנארין, טכנאית תרביות תאים במעבדה של פמלה.
התחילו על ידי גידול בטא גלקטוזידאז המבטא את טריפנוזומה קרוזי אפימסטיגוטס בבקבוק תרבית רקמה T-25 ודגירה בטמפרטורה של 28 מעלות צלזיוס לגידולם באופן אקסני. באמצעות תא נויבאואר, לכמת את צמיחת הטפיל לפני תת-התרבות. לשמירה על התרביות בשלב לוג, תת-תרבות כל 48 עד 72 שעות בחמישה מיליליטרים של מדיום LIT בתוספת 10% FCS וגנטיקאין בסולפט בריכוז סופי של 200 מיקרוגרם למיליליטר.
לאחר מכן סגרו היטב את הכובע לפני דגירה בטמפרטורה של 28 מעלות צלזיוס במצב אנכי. מתרבית שלב הלוג, יש לבצע השעיה של אפימסטיגוטה במדיום LIT בתוספת גנטיקאין וסולפט בריכוז הסופי של 200, 000 תאים למיליליטר אפימסטיגוטה למיליליטר אפימסטיגוטה למיליליטר. לאחר חלוקת 100 מיקרוליטרים של מתלים לכל באר של צלחת באר 96, איפור נפח סופי של 200 מיקרוליטרים עם בינוני.
הפוך את ההשעיה של תאי Vero ב- DMEM לתוספת עם 2%FCS בריכוז הסופי של 100, 000 תאים למיליליטר. זרע 100 מיקרוליטרים של ההשעיה לכל באר בצלחת תרבית רקמה 96 באר. דגירה של התאים למשך הלילה לצורך היצמדות ולמחרת, התבוננו בתאים מתחת למיקרוסקופ.
למחרת, לשטוף את monolayer תא Vero שלוש פעמים עם 100 microliters של PBS סטרילי. הוסף טריפומסטיגוטים מטא-מחזוריים שהתקבלו בעבר. הוסף ריבוי של זיהום או MOI של 10-1 מתוך 100 מיקרוליטרים של DMEM בתוספת 2% FCS לכל באר ודגירה במשך שש שעות כפי שהוכח בעבר.
בסוף הדגירה, שטפו את הצלחת פעמיים עם PBS והוסיפו 100 מיקרוליטרים של DMEM ללא פנול אדום בתוספת 2%FCS. לאחר ביצוע ההשעיה של תאי Vero ב- DMEM מוסיפים את הריכוז הסופי של 1 מיליון תאים למיליליטר. זרע 800, 000 תאים בחמישה מיליליטרים של המדיום בבקבוקי T-25 ודגירה למשך הלילה להדבקת תאים.
לאחר שטיפת הבקבוקון ב-PBS, הוסיפו טריפומסטיגוטים, הוסיפו MOI של 10-1 בחמישה מיליליטרים של DMEM בתוספת 2%FCS ודגרו למשך הלילה כפי שהוכח בעבר. בסוף הדגירה, לשטוף את הבקבוק פעמיים עם PBS. הוסיפו חמישה מיליליטרים של DMEM טרי עם תוספת של 2% FCS ודגירה למשך ארבעה ימים.
בסוף הדגירה, לאחר התבוננות בסופרנאטנט לנוכחות טריפומסטיגוטס תחת מיקרוסקופ אופטי. לכמת את הטריפומסטיגוטים באמצעות תא נויבאואר. אספו את הסופרנאטנט בצינור 15 מיליליטר וצנטריפוגה ב-7, 000 פעמים G במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.
לאחר מכן השליכו את הסופרנטנט והחזירו את הכדור ב-DMEM ללא פנול אדום בתוספת 2%FCS כדי לקבל ריכוז של 1 מיליון טריפומסטיגוטים למיליליטר. זרע 100 microliters של מתלה טריפומסטיגוט לכל באר בצלחת 96 באר. הוסיפו תמיסת בנזנידזול לאפימסטיגוטים, תאי Vero עם אמסטיגוטים, או טריפומסטיגוטים כמתואר בכתב היד של הטקסט.
לאחר מכן דגירו את האפימסטיגוטים, קבעו 28 מעלות צלזיוס במשך 72 שעות ואת הטריפומסטיגוטים או את תאי ה-Vero הדביקו באמהסטיגוטים במשך 24 שעות ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו-חמצני. עבור הבדיקה הצבעמטרית, הגדר את הבארות הריקות על ידי הוספת 100 מיקרוליטרים של PBS או מדיום מתאים. לאחר מכן, הוסף 40 מיקרוליטרים של תמיסת מצע CPRG ו -10 מיקרוליטרים של תמיסת חומרי הניקוי לכל באר לקבלת ריכוז סופי של 200 מיקרומולר CPRG ודטרגנט של 0.1% בנפח סופי של 250 מיקרוליטרים בכל באר.
לאחר הדגירה, ב 37 מעלות צלזיוס במשך שעתיים, למדוד ספיגה ב 595 ננומטר באמצעות ספקטרופוטומטר microplate. בתוכנה, צור פרוטוקול חדש על-ידי בחירת ספיגה כשיטת הזיהוי ונקודת הסיום כסוג הקריאה ולאחר מכן לחץ על אישור. לאחר מכן, הוסף שלב קריאה.
הקלד את אורך הגל שנבחר ולחץ על אישור. במקטע פריסת הלוח סמן את הבארות שיש לקרוא, לחץ על אישור ולחץ על לוח הקריאה, המתן עד שהערכים יופיעו על המסך וייצא אותם לגיליון אלקטרוני כדי לנתח את התוצאות ולחשב את ערכי הספיגה באמצעות חיסור כמתואר בכתב היד. בתוכנת ניתוח סטטיסטי, התווה את ריכוז ה- BZN לעומת הספיגה ב- 595 ננומטר בטבלת XY.
המיר את ריכוזי ה-BZN לערכים לוגריתמיים על-ידי לחיצה על נתח, בחירה באפשרות הטרנספורמציה ולחיצה על אישור. לקבלת ערכי IC50, לחץ על נתח, ומתוך רשימת ניתוח XY בחר התאמה של עקומת רגרסיה לא ליניארית, ולאחר מכן לחץ על אישור. לאחר מכן, עבור אל חלון הפרמטרים, בכרטיסיית המודל, עבור אל קבוצת עיכוב תגובת המינון של משוואות מובנות, בחר מעכב יומן לעומת שיפוע משתנה תגובה לפרמטרים מכיוון ששיטת תגובת המינון השאר את כל הכרטיסיות האחרות בערכי ברירת המחדל ולאחר מכן לחץ, בסדר.
לחץ על סעיף התוצאות כדי למצוא את הערך IC50, את ה- SD ואת טובת ההתאמה. לחץ על מקטע הגרף כדי למצוא את גרף XY של הריכוז הלוגריתמי של התרופה לעומת ערכי הספיגה ולוודא שהתאמת העקומה מופיעה גם בצבע אחר. במחקר הנוכחי, הערך IC50 שהתקבל עבור אפימסטיגוטים היה כ -20 מיקרומולאר, בדומה למחקרים קודמים.
בנוסף, התוצאות הצביעו על פעילות הבטא גלקטוזידאז של האפימסטיגוטים לאורך זמן. חשוב מאוד לבצע לפחות שכפולים של כל מצב שנבדק ושגיאות ממוזערות בניהול אמצעי אחסון.
