שיטה זו מאפשרת לחקור כיצד מצב redox מיטוכונדריאלי מושפע בתנאים פתופיציולוגיים. זה יכול לשמש גם כדי להעריך את היעילות של אסטרטגיות טיפול שמטרתן להגן על המיטוכונדריה. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מאפשרת איבר והערכה ספציפית של שינויים דינמיים ומעקב על מצב מיטוכונדריה redox בזמן אמת.
שיטה זו יכולה להיות משולבת עם אינדיקטורים נוספים לרשום בו זמנית, למשל, פוטנציאל קרום מיטוכונדריאלי או ריכוזי סידן בנוסף למצב redox. פרוטוקול זה יכול להיות מיושם על תאי תרבות, explants רקמה ותרביות פרוסה. התחל על-ידי מיטוב הגדרות המיקרוסקופ הקונפוקלי של הסריקה.
כדי לעשות זאת, הגדר את הגלאי ל- 12 סיביות או 16 סיביות, הפעל את מצב הסריקה הרציף והוסף רצף/רצועה שניים. עבור שני הערוצים, בחר טבלת בדיקת מידע בצבע מדומה המציינת פיקסלים מעל וחלוף תחתון ולאחר מכן בחר מטרה המתאימה לאובייקט העניין. הר כיסוי עם תאים לתוך תא ההדמיה.
הוסף מיליליטר אחד של מאגר הדמיה והניח את התא על המיקרוסקופ. השתמש בעין ובאור המועבר כדי למקד את התאים. הקלט תמונות עם תבניות פיקסלים בגדלים שונים של חורי סיכה.
לאחר מכן להקליט תמונות בעוצמות לייזר שונות ובהתאם להתאים את הרווח ואת הסף גלאי. לבסוף, הקלט תמונות עם מהירויות סריקה שונות ומספרים שונים של ממוצעי מסגרות. עבור הדמיה חיה, הגדר את מרווח הזמן ל- 30 שניות ואת משך הזמן ל- 25 דקות.
לאחר מכן הרכבה על התאים, מניחים את התא על המיקרוסקופ וממקדים את התאים כפי שהודגם בעבר. עבור למצב סריקה והשתמש בערוץ 488 ננומטר בתצוגה החיה כדי להתמקד ולאתר את התאים להדמיה. לחלופינית, כדי להגדיל את מספר התאים המוקלטים בכל ריצה, השתמש בפונקציה מרובת הנקודות כדי לתמונה שניים עד שלושה שדות תצוגה לכל כיסוי.
התחל את רכישת timelapse והקלט חמש תמונות כהקלטה בסיסית של שתי דקות. הוסף 500 מיקרוליטרים של פתרון 3X NMDA לתא כדי להשיג את הריכוז הסופי של 30 מיקרומולר ולרשום 20 תמונות נוספות כתגובת NMDA של 10 דקות. לאחר מכן, הוסף 500 מיקרוליטרים של פתרון DA 4X לתא והקלט שש תמונות נוספות.
שאף את המאגר מתא ההדמיה והחלף אותו במיליליטר אחד של פתרון DTT. לאחר הקלטת 10 תמונות נוספות, סיים את ההקלטה ושמור את סדרת התמונות. לייבוא הנתונים בתוכנת ניתוח התמונה, לחץ על תוספים, בחר תבניות ביו ולאחר מכן יבואן ביו-פורמטים.
בתיבת הדו-שיח , בחר ערכת-על בערימת התצוגה עם, הגדר מצב צבע כברירת מחדל ובחר שינוי קנה מידה אוטומטי. שנה את תבנית התמונה ל- 32 סיביות על-ידי לחיצה על התמונה, בחירת כתב ולאחר מכן מהאפשרויות, בחר 32 סיביות. כדי לפצל את ערוצי הצבע לחלונות נפרדים, לחץ על התמונה, עבור לצבע ובחר ערוצים מפוצלים.
התאם את הסף כדי לבחור את המיטוכונדריה לניתוח על ידי לחיצה על התמונה, בחירת התאמה וסף. בתיבת הדו-שיח , בחר רקע כהה אדום המהווה ברירת מחדל וערום היסטוגרמה. כאשר הפיקסלים שנבחרו נראים אדומים, לחץ על החל.
לאחר מכן בחרו 'הגדר פיקסלי רקע' ל-NAN מעבדים את כל התמונות ובצעו את אותו הליך עבור ערוץ 2. להדמיה של יחס 405 עד 488 ננומטר, צור תמונת יחס על-ידי לחיצה על מחשבון תהליך ותמונה. בתיבת הדו-שיח , בחר ערוץ אחד בתמונה חלק אחד בערוץ הפעולה 2 בתמונה 2.
לאחר מכן בחרו צור חלון חדש ועייץ את כל התמונות. שנה את טבלת בדיקת המידע של תמונת היחס לצבע מדומה על-ידי לחיצה על התמונה, בחירת טבלאות בדיקת מידע ולאחר מכן אש. לניתוח התמונה, צייר ROIs סביב תאים בודדים או מיטוכונדריה בתמונת היחס.
כדי להוסיף את ה- ROIs למנהל ROI, עבור לנתח, לחץ על הכלים, בחר מנהל על ביצוע על ביצועים, לחץ על הוסף ובחר הצג הכל. כדי למדוד את היחסים בין 405 ל-488 ננומטר של תאים בודדים, לחץ על מנהל ההבגיה עלה על ההפרשה, בחר את כל ההעלאות על-ידי הקשה על בקרה A, עבור ליותר ובחר ריבוי מידות. בתיבת הדו-שיח , בחרו 'מדוד את כל הפרוסות ושורה אחת לכל פרוסה'.
לאחר ייצוא המדידות לתוכנת הגיליון האלקטרוני, בחר את תמונת 405 ננומטר, מדוד את עוצמות כל ההחזרים על תנאי ולאחר מכן יצא שוב את המדידות לתוכנת הגיליון האלקטרוני. באופן דומה, למדוד את עוצמות ROI של 488 ננומטר תמונה. לשמירת ההעלות על ההון להריון לעיון עתידי, בחר את כל ההעלות על-ידי הקשה על פקד A, עבור ליותר ובחר שמור.
תמונות מייצגות אלה מהקלטת timelapse מציגות תמונות יחס של נוירונים לפני ואחרי טיפול NMDA ולאחר כיול מרבי/דקה עם DA ו- DTT. טיפול של הנוירונים עם 30 מיקרומולר NMDA המושרה חמצון המיטוכונדריה בתוך כמה דקות. ניתוח של ערוצי פלואורסצנטיות בודדים גילה כי חמצת מיטוכונדריאלית הנגרמת על ידי NMDA גרמה לירידה של פלואורסצנטיות GFP הן על 405 והן 488 ננומטר עירור.
בניסוי בקרה, טרום טיפול עם DA מנע כל חמצון מיטוכונדריה נוסף על ידי NMDA. ובהתאם, יחס 405 עד 488 לא השתנה למרות מרווה ניכר של עוצמת פלואורסצנטיות GFP2 רגישה ל-Redox. ניסוי זה אישר כי יחס 405 עד 488 ננומטר אינו מושפע משינויי pH.
בניסוי נפרד, פוטנציאל הממברנה המיטוכונדריאלית, מצב redox ומורפולוגיה הוערכו במקביל. טיפול של הנוירונים עם 60 micromolar NMDA הביא לאובדן של tetramethylrhodamine או אות TMRE ועלייה ביחס 405 עד 488 ננומטר רו GFP ואחריו כמה עיגול מאוחר של המיטוכונדריה. כאשר אתה מתחיל להשתמש בשיטה זו, חשוב מאוד לקחת זמן כדי למטב בקפידה הגדרות מיקרוסקופיות.
זה יעזור לשמור על הנוירונים בריאים במהלך הניסויים שלך. חשוב גם לכבד תמיד את כללי הבטיחות בלייזר. הקפד לא להיחשף לקרינת לייזר כאשר אתה מוסיף תרופות כדי לחבל במהלך הקלטות חיות.
