פרוטוקול זה חשוב מכיוון שהוא פשוט לביצוע ובהישג יד של כל מעבדה. פרוטוקול זה מאפשר בידוד של HLA או MHC סוג I או פפטידים מסוג II מדגימות אדם או עכבר. שיטה זו יכולה לענות על שאלות מדעיות הקשורות לכל תחומי המחקר הקשורים למערכת החיסון, בין אם בסרטן, וירולוגיה או מחלות אוטואימוניות.
פרוטוקול זה נבנה כדי להיות נגיש לכל מי שעובד במעבדת מחקר. פשוט בצע את השלבים. התחל להפעיל את חרוזי ברומיד ציאנוגן Sepharose על ידי שקילה 80 מיליגרם לכל מדגם והעברתם לצינור חרוטי 15 מיליליטר.
הוסף חמישה מיליליטר של חומצה הידרוכלורית מילימולרית. פיפטה למעלה ולמטה חמש פעמים כדי להקל על resuspension של החרוזים היבשים, ולאחר מכן למלא את הצינור החרוטי עם 8.5 מיליליטרים נוספים של חומצה הידרוכלורית מילימטר אחד. סובב את החרוזים במהירות של 20 סל"ד למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר באמצעות התקן מסתובב.
צנטריפוגה החרוזים ב 200x G במשך שתי דקות בטמפרטורת החדר ולהסיר את supernatant על ידי שאיפה. הוסף 500 מיקרוליטרים של חיץ צימוד לפלטת החרוזים, ולאחר מכן העבר את מתלה החרוזים לצינור צנטריפוגה חדש של שני מיליליטר והניחו אותו בצד. לצימוד הנוגדנים לחרוזים אלה, הוסיפו שני מיליגרם של הנוגדן הנבחר בצינור מיקרו-צנטריפוגה חדש של שני מיליליטר והרכיבו את הנפח למיליליטר אחד עם תמיסת חיץ צימוד כדי לקבל ריכוז סופי של שני מיליגרם למיליליטר.
העבר את פתרון החרוזים שהוכן בעבר והוסף אותו לתמיסת הנוגדנים. לאחר מכן, לסובב את צינור microcentrifuge ב 20 סל"ד במשך 120 דקות באמצעות התקן סיבוב, צנטריפוגה החרוזים, ולאחר מכן להסיר את supernatant כפי שתואר קודם לכן. עכשיו להתחיל לחסום ולשטוף את החרוזים על ידי הוספת מיליליטר אחד של 0.2-טוחן גליצין לצינור microcentrifuge המכיל את החרוזים מצמידים נוגדנים, וסיבוב ב 20 סל"ד במשך 60 דקות בטמפרטורת החדר באמצעות מכשיר סיבוב.
לאחר צנטריפוגה והסרה של supernatant, לשטוף את החרוזים עם PBS מיליליטר אחד, להסיר את supernatant על ידי צנטריפוגה, ולאחסן את החרוזים במיליליטר אחד של PBS בארבע מעלות צלזיוס עד השימוש. כדי לבודד פפטידים מסוג MHC I או II, הפשירו פלטה קפואה של 100 מיליון תאים על ידי חימום תחתית הצינור בכף היד. הוסיפו 500 מיקרוליטרים של PBS ללוח הצבעים ופיפטה למעלה ולמטה עד שהמתלה יהיה הומוגני.
העבר את ההשעיה בצינור מיקרו-צנטריפוגה חדש של שני מיליליטר והוסף נפח שווה של מאגר תמוגה לתאים. סובב במהירות של 10 סל"ד למשך 60 דקות בארבע מעלות צלזיוס באמצעות התקן סיבוב. צנטריפוגה lysate התא ב 18, 000x G במשך 20 דקות בארבע מעלות צלזיוס עם בלם מלא, ולהעביר את supernatant בצינור מיקרוצנטריפוגה חדש, שני מיליליטר.
לשחזר את החרוזים מצמידים נוגדנים על ידי צנטריפוגה והסרת supernatant. לאחר מכן, להעביר את התא lysate supernatant לחרוזים מצמידים נוגדנים, ודגור ב 10 סל"ד במשך 14 עד 18 שעות לילה בארבע מעלות צלזיוס באמצעות מכשיר מסתובב. ביום השני, הסר את המכסה התחתון של עמודת הפוליפרופילן, הנח את העמודה על ארון העמודות פוליפרופילן, והתקן מיכל ריק מתחת כדי לאסוף זרימה דרך.
עכשיו לשטוף את עמוד פוליפרופילן עם 10 מיליליטר של חוצץ A ולתת לו לנקז על ידי כוח המשיכה. אם מהירות הזרימה של ההמלטות הנוזלית איטית מדי, חתוך עוד יותר את הקצה התחתון של עמודת הפוליפרופילן. מודדים ואוספים את תערובת החרוזים/ליסט ומעבירים אותה לעמודת הפוליפרופילן.
תן לתערובת הנוזלית לברוח על ידי כוח המשיכה. לחלופין, לאסוף ולהקפיא 20 microliters של aliquot עבור סופג מערבי. עכשיו לשטוף את החרוזים שנשמרו בעמודה פוליפרופילן על ידי הוספת 10 מיליליטר של חוצץ A ולתת לו לברוח על ידי כוח המשיכה.
הסר עמוד פוליפרופילן מהמדף והנח אותו על גבי צינור מיקרוצנטריפוגה חדש, שני מיליליטר, מחזיק את העמוד ואת הצינור יחד עם היד. הוסף 300 מיקרוליטרים של 1%TFA לעמודת הפוליפרופילן וערבב את החרוזים על ידי צנרת למעלה ולמטה חמש פעמים. לאחר מכן, להעביר את ההמלטה בצינור מיקרוצנטריפוגה חדש, שני מיליליטר.
להתפלה וניצול של פפטידים MHC, הוסף 200 מיקרוליטרים של מתנול על גבי עמודת C-18 וצנטריפוגה ב 1, 546x G במשך שלוש דקות כדי להשליך את הזרימה דרך. הוסף 200 מיקרוליטרים של 80% אצטוויטריל ב- 0.1%TFA מעל העמודה C-18 ושוב צנטריפוגה כדי להשליך את הזרימה. לאחר מכן, הוסיפו 200 מיקרוליטרים של 0.1%TFA, תוך ביטול הזרימה דרך צנטריפוגה.
לבסוף, טען 200 מיקרוליטרים של מתחמי הפפטידים של MHC על גבי עמודת C-18, בטל את הזרימה באמצעות צנטריפוגה וחזור על הפעולה עד לטעינת הנפח המלא. לאחר מכן, הוסף 200 מיקרוליטרים של 0.1%TFA, צנטריפוגה כדי להשליך את הזרימה דרך, העבר את עמודת C-18 לצינור מיקרו-צנטריפוגה חדש של שני מיליליטר, והתחמק מפפטידים MHC על ידי הוספת 150 מיקרוליטרים של 28% אצטוניטריל ב- 0.1%TFA. לאחר צנטריפוגה, לאסוף את הזרימה דרך בצינור מיקרוצנטריפוגה חדש, 1.5 מיליליטר.
חזור על תהליך ההמלטה פעמיים עבור נפח כולל של 450 מיקרוליטרים, וקפאה במינוס 20 מעלות צלזיוס עד לניתוח על ידי LC-MS-MS. השתמש פפטידים מטוהרים אלה לזיהוי של פפטידים מסוג MHC I ו- II בספקטרומטר מסה. היעילות המחייבת של חרוזים באה לידי ביטוי בירידה משמעותית בעוצמת כתמי האות של שרשראות קלות וכבדות כאשר החרוזים קשורים באופן קוולנטי לחרוזי CNBr, בהשוואה לנוגדן לפני הזיווג.
הבידוד של מתחמי פפטיד MHC בעקבות התחמקות חומצית אושר על ידי אות הזיהוי החזק של מתחמי פפטיד MHC באמצעות נוגדן נגד HAL-ABC שרשרת כבדה. כמו כן, הוערך יכולת השכפול הפנים-אישית של התוצאות באמצעות הפרוטוקול הנוכחי. המקדם הממוצע של וריאציה עבור מספר הפפטידים שזוהו על פני שלושה העתקים ביולוגיים שונים היה קטן, אשר השתנה בין 1.9 ל 11%עם זאת, זהות הפפטידים השתנה במידה ניכרת, ואת שיעור הפפטידים זוהו רבייה על פני שלושה replicates ביולוגי נע בין 39% ל 63%, מפות החום שנוצרו הראו כוח מחייב MHC חזוי של הפפטידים מזוהים.
עבור העכבר MHC class I ופפטידים מדרגה II, הקלסרים החזקים או החלשים היו 89 ו -87% בהתאמה. עבור פפטידים אנושיים מסוג HLA I ופפטידים מדרגה II, הקלסרים החזקים או החלשים היו 97 ו -70% בהתאמה. מוטיבים מחייבים פפטיד של העכבר ואנושי עבור LHC בכיתה I ופפטידים בכיתה II נוצרו גם.
לפני האופטימיזציה של פרוטוקול זה, הבידוד של פפטידים מסוג MHC MHC ו- II היה די קשה. פרוטוקול ממוטב זה יאפשר בידוד של פפטידים מסוג MHC MHC ו- II ממודלים של עכבר ויוו, למשל, המשמשים באופן שגרתי לאימות מחקרים רבים ומגוונים הקשורים למחלות.
