צפיפות הדרגתית אולטרה-מרכזית לחקירת מיחזור אנדוציטי בתאי יונקים

פרוטוקול זה מסייע בבידוד אנדוזומים למיחזור המכילים שברים מתאי יונקים שהודבקו כדי להקל על החקירה של סחר בחלבון באמצעות סחר אנדוציטי. טכניקה זו קלה לטיפול וישימה הן רקמות והן דגימות תא. מדגים את ההליך יהיה מיס Zhai יו צ'י, דוקטורנט מהמעבדה של ד"ר לאו.

בתור התחלה, צלחת 2 כפול 10 עד 6 תאים בצלחת תרבית 100 מ"מ. למחרת, להעביר את התאים עם Lipofectamine על פי הוראות היצרן. כדי לקצור את התאים, להשליך את המדיום התרבותי 48 שעות לאחר transfection ולשטוף את התאים פעמיים עם PBS קר כקרח.

לאחר מכן הוסיפו מיליליטר אחד של PBS קר כקרח בתוספת קוקטייל מעכב פרוטאז 0.5X בקוקטייל מעכב פוספטאז 0.5X לכל מנה. לאחר מכן, באמצעות מגרד תאים, לאסוף את התאים ולהעביר את השעיית התא לצינור צנטריפוגה 15 מיליליטר. התאים על ידי צנטריפוגה באמצעות רוטור דלי נדנדה.

השליכו את הסופר-נט וחידשו את גלולה התא בעדינות בחמישה מיליליטרים של חוצץ הומוגניזציה. לאסוף את התאים שוב על ידי צנטריפוגה ו resuspend גלולה התא במיליליטר אחד של חוצץ הומוגניזציה. הומוגניזציה התאים עם הומוגניזר Dounce באמצעות 15 עד 20 משיכות.

ואז להעביר את homogonate לצינור צנטריפוגה שני מיליליטר. הוסף 700 מיקרוליטרים של חוצץ הומוגניזציה להומוגונאט. ואז לסובב את homogonate מדולל ולאסוף 1.5 מיליליטר של supernatant.

לסובב את supernatant שנאסף שוב, ולאחר מכן לאסוף 1.4 מיליליטר של supernatant ולתייג אותו כמו לאחר גרעינית-על-טבעי. כדי להכין את עמודת שיפוע הצפיפות, העבר 1.2 מיליליטר של supernatant פוסט גרעיני לצינור אולטרה צנטריפוגה. לאחר מכן להוסיף מיליליטר אחד של 62% תמיסת סוכרוז לדגימה ולערבב היטב על ידי pipetting עדין.

לאחר מכן, בזהירות להוסיף 3.3 מיליליטר של 35% תמיסת סוכרוז על גבי המדגם, ואחריו 2.2 מיליליטר של 25% תמיסת סוכרוז על גבי פתרון 35%סוכרוז. לבסוף, מלא את צינור ultracentrifuge למעלה עם חוצץ הומוגניזציה. צנטריפוגה את עמודת מעבר הצבע של הצפיפות ואסוף בזהירות 12 שברים של 1 מיליליטר כל אחד, החל מהחלק העליון של מעבר הצבע.

לאחר מכן, לדלל את כל השברים עם מיליליטר אחד של חוצץ דילול וצנטריפוגה הדגימות מדולל. לאחר צנטריפוגה, לשאוף supernatant ולהוסיף 50 microliters של חוצץ מדגם 1X כדי לקצור את השברים. סמן המיחזור הסוף Rab11 זוהה בשבריר שבע.

סמנים תת-תאיים אחרים, כולל בטא COP, COX IV, GAPDH, EEA1, ראב 7, ו Lamp1 נחקרו גם הם. אות EEA1 חיובי זוהה גם בשבר שבע. עוצמות הרצועה הנמדדות של GAPDH, קוקס 4 ו-Rab11 הן בשבר שבע והן בסופר-נטאנט הפוסט-גרעיני מוצגות כאן.

לאחר חוצה תאי HEC293 עם ELMO1, ELMO1 ARF6Q67L, או ELMO1 ARF6Q67L FE65, לא נמצאו שינויים בהפצת ELMO1 עם ביטוי יתר ARF6Q67L ו- FE65. רמת ELMO1 בשבר שבע הושוותה בין transfections שונים ונמצאה מוגבהת לאחר cotransfection של ARF6Q67L. עלייה נוספת נצפתה כאשר הן ARF6Q67L והן FE65 התבטאו במשותף.

לעומת זאת, נוקאאוט FE65 צמצם את העשרת ELmo1 בתיווך ARF6 בשבריר שבע. השבר שהושג יכול לשמש לניתוח הבא. לדוגמה, סופג מערבי כדי לדמיין שינויים ברמת החלבון בשבר.