Escherichia Coli הוא החיידק הגרם שלילי הנפוץ ביותר גורם דלקת קרום המוח יילודים. המופע של דלקת קרום המוח חיידקי יילודים אך ורק מתחיל עם החיידק ולאחר מכן החיידקים בדם לחדור דרך מחסום הדם מוח כדי לגרום לדלקת קרום המוח. נויטרופילים הם קו ההגנה הראשון מפני זיהומים חיידקיים.
במהלך פלישת חיידקים, נויטרופילים פעיל לשחרר ROS. ROS מייצג את המנגנונים הבקטריוציאליים העיקריים של תאים מארחים כדי להרוס את הפתוגנים הפולשים. מדידת הייצור של ROS בנייטרופילים היא שיטה שימושית להתחלת ההגנה של המארח במהלך אינטראקציה מארח חיידקים.
קח מושבת חיידקים אחת מהצלחת עם פיפטה סטרילית ולשים אותו בחמישה מיליליטר המוח לב עירוי מדיום המכיל ריפאמפיצין בבקבוק קעור. דגירה את תרבות החיידקים ב 37 צלזיוס, עם 90 סל"ד במשך 17 שעות בשייקר הדגירה. צנטריפוגה דגימות הדם ההיקפיות ב 2000 סל"ד במשך חמש דקות.
לאחר צנטריפוגה, דגימות הדם מחולקות לשלוש שכבות. מלמטה למעלה, שכבת תאי הדם האדומים, שכבת תאי הדם הלבנים ושכבת הפלזמה. לשאוף את שכבת תאי הדם הלבנים לצינור חדש עם פיפטה סטרילית.
מוסיפים חיץ תמוגה תלת-פעמי של תאי דם אדומים. מערבבים את התערובת ביסודיות, ומניחים בטמפרטורת החדר במשך חמש דקות. צנטריפוגה הצינור ב 2000 סל"ד במשך חמש דקות.
לשאוף את העל-טבעי לחלוטין ולהשליך. חזור על הליך התמוגה של כדוריות דם אדומות במשך פעם או פעמיים, עד משקעים להפוך לבן. לשטוף את התאים על ידי השעיה מחדש של המשקע עם PBS שני מיליליטר.
ואז צנטריפוגה הצינור ב 1000 סל"ד במשך חמש דקות. תחדש את המשקע עם 15 מיקרוליטר קוד מקדים מאגר מיון תאים מגנטיים עבור 15 מיליון תאים. מוסיפים 15 מיקרוביאדות מגנטיות מיקרוליטר ומערבבים היטב.
הדגירה את התערובת בארבעה צלזיוס במשך 30 דקות. בתנאים רגילים, לאדם הבוגר יש בערך 4 עד 10,000 תאי דם לבנים לכל דם מיקרוליטר. אז העלות של סה"כ תאי דם לבנים בדם היקפי אנושי 5 מיליליטר, כמעט פחות מ -50 מיליון.
ו-50 חרוזים מגנטיים מיקרוליטר ב-15 מאגר מיון מגנטי מיקרוליטר זה מספיק. האחוז הנורמלי של הנויטרופילים הוא 50 עד 70% מכלל תאי הדם הלבנים. אז בערך 10 מיליון נויטרופילים יכולים להתקבל מדם של חמישה מיליליטר.
לשטוף את התאים על ידי הוספת חיץ מיון מגנטי שני מיליליטר, לכל 10 מיליון תאים לצינור, וצנטריפוגה בארבעה צלזיוס, 1, 200 סל"ד במשך 10 דקות. להרכיב את העמודה המגנטית ולהפריד מדף. השלך את supernatant לחלוטין, ולהשתיל מחדש את המשקעים עם 500 מאגר מיון מגנטי microliter עבור עד 100 מיליון תאים.
שטף את העמודה עם חיץ מיון מגנטי של 3 מיליליטר. החל את השעיית התא על העמודה כדי לאפשר את נויטרופילים שכותרתו על ידי חרוזים מגנטיים, מחובר לעמודה. שטף את התאים הספציפיים שאינם ספציפיים על ידי הוספת מאגר של שלושה מיליליטר במשך שלוש פעמים, לאחר מאגר העמודות ריק בכל פעם.
הסר את העמודה מהמפריד המגנטי, והכנס אותה לצינור חדש. הוסף חיץ מיון מגנטי של 5 מיליליטר לעמודה. לדחוף את התאים המסומנים מגנטי באמצעות בוכנה.
צנטריפוגה הצינור ב 1, 200 סל"ד במשך חמש דקות. שאפו את הסופרנט לחלוטין, ובזבזו מחדש את המשקע עם מדיום תרבות מיליליטר אחד. קבע את מספר התא עם מונה.
התאים את ריכוז התאים ל-2 מיליון למיליליטר במדיום התרבות המכיל בדיקת פלואורסצנטיות DHE. מניחים את הנויטרופילים באינקובטור במשך 30 דקות כדי לטעון את הגשוש DHE. הקצה את המתלה התא למיקרופלאט שחור 96 באר עם 200 מיקרוליטר לבאר.
הפעל את קורא המיקרופלאטים. הגדר את הטמפרטורה ל- 37 צלזיוס, בחר מצב קריאת פלואורסצנטיות, סוג קריאה קינטי, הגדר את אורך הגל של הפלואורסצנטיות. בחר את תבנית הלוח.
קבע את אזור הקריאה. למדוד את עוצמת הפלואורסצנטיות כל חמש דקות במשך שעה. מנערים את הצלחת במשך שלוש שניות לפני כל קריאה.
תוציא את המיקרופלטה מהאינקובטור. הוסף זני PMA או E44 עם שלוש חזרות. שים את הצלחת בקורא microplate, לחץ על לחצן התחל כדי להתחיל את ההסתעפות מיד.
באמצעות קווי המתאר של הפרוטוקול במאמר זה, הנויטרופילים היו מבודדים מהדם ההיקפי האנושי, ועמוסים בבדיקת פלואורסצנטיות DHE. על ידי הוספת PMA, ROS תאיים נויטרופילים, הראה עלייה משמעותית מ 20 ל 40 דקות, והגיע לשיא ב 60 דקות. אבל אני חושב E44 זנים, ייצור ROS מתרחשת באופן מיידי ומגדיל את הזמן תלוי.
הביטוי של ROS שנגרם על ידי זן E44 דומה לזה שנגרם על ידי PMA. הגילוי של ייצור ROS בניטרופילים עשוי לתרום למחקר נוסף של המנגנונים הבקטריוציאליים של נויטרופילים. בפרוטוקול זה, אנו מספקים דרך קלה יותר לזהות את ייצור ROS בנויטרופילים באופן בזמן אמת.
השיטה הפשוטה יכולה לשמש גם כדי לפקח על ייצור ROS בסוגי תאים מארחים אחרים במהלך אינטראקציות מארח-חיידקים.
