בדיקה זו של הדמיית במבחנה מאפשרת לכמת את ההשפעה של טיפולים שונים בתאים או גנוטיפים שונים על פגוציטוזיס מיקרוגליאלי. באמצעות שני סוגי תאים הרלוונטיים למחלות ניווניות, אנו משתמשים בתאי נוירובלסטומה מתים עבור המטען הפגוציטי, אשר מוכנים באופן שניתן להגדיל בקלות ובזול על ידי מסכי הדמיה גדולים בעלי תוכן גבוה. בארון בטיחות ביולוגי מדרגה 2, נתק SH-SY5Ys על ידי שאיפת המדיום.
הוסף 4 מ"ל של מאגר דיסוציאציה של תאים, והסר את המאגר באופן מיידי כך שפחות מ- 1 מ"ל יישאר כסרט דק המצפיף את התאים. דגירה במשך 2 עד 3 דקות ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני. ואז ב 10 מ"ל של HBSS לבקבוק T-75.
וצינורות SH-SY5Ys לתוך צינור צנטריפוגה חרוט 15 מ"ל. צנטריפוגה ב-400xG למשך 5 דקות. שאפו את supernatant, ולהשעות מחדש את התאים ב 2 מ"ל של פנול ללא אדום HEPES מדיה חוצצת, הקפד לשבור גושים לפני קיבעון.
תקן את התאים על ידי הוספת 2 מ"ל של 4% פורמלדהיד כוח לצינור ודגרה במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר עם תסיסה עדינה מדי פעם. הוסף 10 מ"ל של HBSS לצינור. לאחר מכן, צנטריפוגה ב 1200xG במשך 7 דקות.
שאפו את supernatant, ולהשעות מחדש את גלולה התא ב 2 מ"ל של פנול אדום חינם HEPES חוצץ מדיה. לספור ולהסיר 1 מיליון תאי HS-SY5Y לתוך צינור 2 מ"ל חלבון מחייב נמוך. הבא את הנפח הכולל ל- 300 עד 500 מיקרוליטרים עם מדיה חוצצה נטולת פנול HEPES.
ואז לחמם לזמן קצר את הצינור באמבט מים 37 מעלות צלזיוס. לערוך מחדש את אסתר STP צבע פלואורסצנטי אדום רגיש pH בהתאם להוראות היצרן. לאחר מכן הוסיפו 12.5 מיקרוגרם צבע למיליון תאי SH-SY5Y.
מערבבים בעדינות על ידי הבהוב הצינור. ודגרת הצינור בטמפרטורת החדר במשך 30 דקות, מוגן מפני אור. מוסיפים 1 מ"ל של HBSS וצנטריפוגה ב 1200xG במשך 7 דקות ו 4 מעלות צלזיוס.
זרוק את סופר-טבעי. ולשטוף עם 2 מ"ל של HBSS. להשעות מחדש את גלולה התא בפנול אדום חינם מקרופאגים מדיה לריכוז של 0.2 עד 1.2 מיליון תאים למ"ל, כך 50 microliters מכילים 10, 000 עד 60, 000 תאים.
בארון בטיחות ביולוגי, להכין פתרון של תא פלואורסצנטי עמוק אדום חלחל צבע אקסטר תגובתי בתקשורת מקרופאגים. הוסף Hoechst 33342, ולחמם את פתרון העבודה ל 37 מעלות צלזיוס באמבט מים. שאפו את המקרופאג' של IPSC בעדינות, על ידי הזרקת סופרנט התא עם פיפטה רב ערוצית למאגר סטרילי.
הוסף 70 מיקרוליטרים לבאר של פתרון הצבע למקרופאגים של iPSC באמצעות פיפטה רב-ערוצית. דגירה במשך שעה אחת ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני. תיקון טיפולים ניסיוניים בתקשורת מקרופאג' נטולת אדום פנול.
לאחר הדגירה, שאפו את המדיום מקרופאג' IPSC בעדינות רבה עם פיפטה רב ערוצית, והוסיפו 100 מיקרוליטרים של HBSS לבאר. הסר מיד HBSS על ידי צנרת עדינה. לאחר מכן להוסיף 100 microliters של פנול אדום חינם מקרופאג מדיה, בתוספת טיפולים ניסיוניים בבארות נפרדות.
דגירה במשך 10 דקות עד שעה אחת ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני. השתמש בצינור רב ערוצי כדי להוסיף 50 מיקרוליטרים של SH-SY5Ys שכותרתו לבאר מצדי כל באר בקצה הנוזל. ואז לדגור ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני במשך 3 עד 5 שעות.
לאחר הדגירה של פאגוציטוזיס, שאפו בעדינות את צינורות-על התאים על ידי צנרת עם פיפטה רב ערוצית והשליכו. לשטוף פעם אחת עם 100 microliters של PBS. לאחר מכן לתקן את התאים על ידי הוספת 100 microliters של 2% פורמלדהיד כוח ודגרה במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר.
שאפו בארות והוסיפו 100 מיקרוליטרים של PBS. או להמשיך ישירות להדמיה עם מיקרוסקופ תוכן גבוה, או לכסות עם איטום צלחת רדיד אלומיניום, ולאחסן את הצלחת ב 4 מעלות צלזיוס, עד הצורך. הפעל את מיקרוסקופ ההדמיה בעל התוכן הגבוה ופתח את תוכנת לכידת התמונות.
טען את צלחת בדיקת לתוך המיקרוסקופ על ידי לחיצה על סמל LOAD"בחלק העליון של המסך. בחר את הכרטיסיה SETUP". בתפריטים הנפתחים בתיבה הימנית העליונה, בחר את סוג הלוח המתאים.
אפשרות המיקוד האוטומטי: שתי שיא"המטרה:40x מים, NA 1.1"קונפוקלי", ו Binning של 1. יש לשטוף את המטרה 40x Water לפני השימוש דרך תפריט ההגדרות. בתיבת הבחירה של הערוץ, השתמש בסמל הפלוס כדי להוסיף את הערוצים DAPI, Alexa 647 ו- Alexa 568.
הגדר אלה כדי למדוד במישור אחד של מיקרומטר אחד. מטב את הגדרות הזמן והחשמל ליעילות הכתמים של צלחת ה- assay. ודא הערוצים אינם נמדדים בו זמנית, על ידי לחיצה על רצף הערוצים כדי להפריד את הערוצים.
תחת ניווט והגדר פריסה, בחר את בארות המידה ובחר 9 עד 12 שדות לבאר. במהלך ההתקנה, לחץ על שדה מייצג במפת הלוח. ובדוק כל ערוץ מדידה בתורו כדי לוודא שהכתמים קיימים, ושהתמונות ממוקדות על-ידי התאמת היסט הערוץ.
כדי להעלות את הנתונים לשרת לניתוח מרחוק, לחץ על התיבה משימות מקוונות ושם המסך הרלוונטי. שמור את פרוטוקול ה- assay על ידי לחיצה על כפתור השמירה, ולחץ על ניסוי הריצה"כרטיסיה בחלק העליון. שם צלחת הניסוי, ולאחר מכן לחץ על start"זמן תא חי חי phagocytosis בדיקה הראה כי עם 10, 000 SH-SY5Ys לכל טוב, מספר חלקיקי פאגוציטוז לתא גדל ליניארית עם הזמן היה מעוכב על ידי כ 50%ידי Cytochalasin D.עם כמויות גבוהות יותר של SH-SY5Ys לבאר, phagocytosis הפגין ליניאריות ירודה, ככל הנראה בשל פילוח לקוי של iPSC, מקרופאגים ו- SH-SY5Y בשדה ראייה צפוף יותר.
התוצאות הבאות התקבלו על ידי ביצוע הדמיה של תוכן גבוה של תאים קבועים, כולל תמונה מייצגת זו של פאגוציטוזיס. הגדלת כמות SH-SY5Ys הביאה למספר גבוה יותר של חלקיקי פאגוציטוס לתא. התזווגות אסאי אומתה באמצעות מספר מעכבים של פאגוציטוזיס.
ציטוצ'אלסין D ו Jasplakinolide עכבות באופן משמעותי פאגוציטוזיס על ידי 91 ו 90 אחוזים בהתאמה. ו Bafilomycin A1 הפחית באופן משמעותי פאגוציטוזיס על ידי 31%כאשר דגירה מראש במשך שעה אחת לפני phagocytosis. תוספת של נספח רקומביננטי 5 מופחת באופן משמעותי phagocytosis על ידי 30%כאשר נוסף בארות מיד לפני תוספת SH-SY5Y.
קבוע SH-SY5Ys אנו אישרו לחשוף פוספטידילסרין באמצעות גשושית אגף פלואורסצנטי 5. בעוד ש-SH-SY5Ys חיים היו שליליים עבור כתמי נספח 5. מספר אורכים של משך פאגוציטוזיס, מ 1 עד 5 שעות, נבדקו באמצעות תוספת מדהימה של מטען פאגוציטי.
ניתן לקצר את האורך הכולל של פרוטוקול זה על ידי הכנת המטען הפאגוציטי והכתמת המקרופאגים של IPSC במקביל. אם אתה רוצה לעשות זאת, לעבוד על התזמונים מראש, ולהשתמש הדגירה שלך כדי להכין פתרונות לשלבים העתידיים.
