הבנת היעילות של תרופות במודלים של בעלי חיים היא עלות ועבודה אינטנסיבית. הפרוטוקול שלנו המשתמש במודל explant רקמת ex vivo הוא נמוך באופן משמעותי הן מבחינת עלות וכוח אדם מדעי הנדרשים כדי לנהל את המחקר. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא השימוש בעיני חזירים, אשר יש אנטומיה ופיזיולוגיה דומה מאוד לעיניים אנושיות לעומת כמה מודלים בעלי חיים קטנים אחרים.
כאשר אנו בודקים תרופות במבחנה, הם עשויים להראות יעילות אשר עשוי להיעדר במודלים של בעלי חיים או בני אדם. מערכות רקמות Ex vivo הן הדרך הטובה ביותר להבין אם ניתן לתרגם את מערכות ההבחנה שלנו לניסויים בבעלי חיים ובבני אדם. מערכת הקרנית החזירית, אם כי פחות עבודה אינטנסיבית, דורשת מיומנויות הכשרה כדי לבודד, לשמור, להדביק ולטפל עם התרופות, במיוחד תהליך הבידוד של קרנית מכל עין החזיר הוא מסובך להביע במילים, אבל דורש הדגמה חזותית.
עם קבלת עיני חזיר ממוכר מתאים, יש לאחסן את הרקמות על הקרח עד לעיבוד ולשים את ציוד ההגנה האישי המתאים. לחטא את אזור העבודה עם 70% אתנול ולהבטיח כיסוי ספסל על סביבת העבודה. כאשר אזור העבודה מוכן, מניחים את העיניים על חתיכת גזה של 50 מ"מ והשתמשו בגזה כדי לתפוס את החלק האחורי ביד אחת.
באמצעות מחט 30 מד, בזהירות לעשות ניקוב אחד בערך במרכז המשטח האפיתל של העין, דואג לא לפגוע stroma, ולהשתמש בלהב מעוקר חד לעשות חותך קטן על הסקלרה במרחק מילימטר אחד מן הקרנית. באמצעות פעולה מסתובבת מהירה וחלקה של היד ולדאוג כי ההומור הזגג אינו דולף, לחתוך את קצה הקרנית ולהחזיק את הקרנית בקצה הקרנית-sclera עם פינצטה שטוחה, להשתמש בלהב כדי לחתוך את הקרומים הקשורים הנותרים. כאשר כל קרנית מבודדת, מניחים את הרקמות עם הפנים כלפי מעלה לבארות בודדות של צלחת של 12 באר המכילה שני מיליליטר של קרנית בינונית לבאר ולהוסיף חמישה מיקרוליטרים של חמש פעמים 10 ליחידה החמישית ליצירת פלאק של פתרון וירוס 17 GFP לאתר המושחת על כל משטח הקרנית.
כאשר כל הקרניות נאספו, מניחים את הצלחת ב 37 מעלות צלזיוס, 5% אינקובטור דו תחמוצת הפחמן במשך 72 שעות לרסס כל עיניים נוספות שלא נעשה שימוש בניסוי עם 10% אקונומיקה לסילוק מאובטח שלהם בשקיות biohazard. כל יום לפני הוספת התרופות, מניחים את צלחת הקרניות תחת מיקרוסקופ סטריאו ובחרו את מסנן GFP וזמן חשיפה של 500 מיקרו שניות. ללכוד את התמונות בהגדלה הנמוכה ביותר לפני הדמיית הקרניות בסדרה של הגדלות הולכות וגדלות עד שניתן לדמיין בבירור את כל ההתפשטות הנגיפית ואת היווצרות הדנדריט.
כאשר כל הקרניות כבר בתמונה, להחזיר את הצלחת לאינקובטור תרבית הרקמות. יום לפני הזיהום, לשטוף תרבית תאים vero confluent פעמיים עם 10 מיליליטר של PBS לכל לשטוף, ולטפל בתאים עם מיליליטר אחד של 0.05%טריפסין לבאר במשך חמש עד 10 דקות ב 37 מעלות צלזיוס. כאשר התאים התנתקו, השתמש בתשעה מיליליטרים של מדיום שלם כדי להבטיח שהתאים יתנתקו לחלוטין ממשטח הבקבוק ויעבירו את השעיית התא המתקבלת לצינור צנטריפוגה של 15 מיליליטר.
הוסף 300 microliters של תאים לכל באר של צלחת חדשה של שישה היטב, ואחריו תוספת של שני מיליליטר של בינוני לכל באר, ולאחר מכן למקם את הצלחת בחממה תרבית התא לילה. למחרת בבוקר, כדי לאסוף את הנגיף מכל קרנית לכימות, להשרות טיפים צמר גפן סטרילי ב 500 microliters של בינוני ללא סרום לכל ספוגית בצינורות microcentrifuge מרובים בארון בטיחות ביולוגית במשך חמש דקות לפחות. בסוף הדגירה, הניחו בזהירות את תרביות הקרנית החזירית הנגועות בארון.
באמצעות צמר גפן רטוב, לעשות שלוש מהפכות בכיוון השעון ושלוש מהפכות נגד כיוון השעון חמישה מילימטרים ממרכז כל קרנית חזיר נגועה מבלי להפעיל לחץ מוגזם. בסוף סדרת המהפכות, סובבו כל דגימה בצינור המיקרוצנטריפוגה הבינוני נטול הסרום שלה בכיוון השעון ונגד כיוון השעון חמש פעמים לפני חיתוך הדגימות כך שהקצוות יתאימו לכל צינור עם המכסה סגור. כאשר כל הקרניות כבר ספוגות, מערבולת הצינורות במהירות גבוהה במשך דקה אחת.
כדי לכמת את כמות הנגיף שנאספה מכל קרנית, הכינו דילול של הנגיף פי 10 במדיום נטול סרום בצינורות מיקרוצנטריפוגה עד להגעה לדילול של פעם אחת כפול 10 עד שמונה השליליות. לאחר שאיפת מדיום הצמיחה מכל באר של תאים, להעביר מיליליטר אחד של כל דילול וירוס החל פעם אחת 10 אל השלישייה השלילית למונווליות התא מצופה ומניחים את התאים הנגועים באינקובטור תרבית התא במשך שעתיים. בסוף הדגירה, לשטוף בעדינות כל טוב פעמיים עם PBS לפני הוספת שני מיליליטר של מדיום עמוס methylcellulose לכל באר עבור דגירה של 72 שעות או עד היווצרות של לוחות ניתן לראות.
לאחר תצפית פלאק, לאט להוסיף מיליליטר אחד של מתנול לפינה של כל באר עבור דגירה של 15 דקות בטמפרטורת החדר. בסוף הדגירה, לאט לשאוף את התוכן מכל באר מבלי להפריע monolayer התא. לאחר מכן, לתייג כל באר עם מיליליטר אחד של פתרון עבודה סגול קריסטל, תוך טיפול כי כל התאים מכוסים דגירה של 30 דקות מוגן מפני אור.
בסוף הדגירה, להשליך את הפתרון ולייבש את הבארות על גיליון של נייר סופג, ולאחר מכן לספור את מספר הלוחות בבאר הדילול הגבוה ביותר כדי לכמת את התוכן הכולל של וירוס בפתרון ההתחלה שלוש פעמים. כפי שנצפו בניתוח הדמיית פלואורסצנטיות סטריאוסקופית זו, היעילות האנטי ויראלית של BX795 דומה לזו של TFT בשליטה על התפשטות נגיפית, בעוד קרניות שטופלו ברכב רק מדגימות את התפשטות הנגיף מאזור הזיהום המרכזי לפריפריה בשישה ימים לאחר חיסון ויראלי ראשוני. באופן דומה, דגימות העין שנלקחו בימים שניים וארבע לאחר ההדבקה מפגינים עיכוב מוחלט של הנגיף בבקרה החיובית ודגימות שטופלו ב- BX795, בעוד עלייה חדה בטיטר הנגיף הזיהומי נצפתה בדגימות הבקרה השלילית.
בידוד הקרנית החזירית מכל עין החזיר הוא הצעד החשוב ביותר. שלבים 2.3 עד 2.6 הם הקריטיים ביותר בתהליך זה. המודל שלנו יכול לשמש כדי להבין את ההתפשטות הדנדריטית של הנגיף בקרניות חזירים.
שיטה זו יכולה להיות מורחבת כלפי זיהומים חיידקיים ופטריות גם כן. שיטה זו סייעה לדמיין התפשטות דנדריטית של הנגיף בקרניות מחוץ למודל אנושי. מודל זה מסייע בבדיקת היעילות של תרופות לפני המעבר לניסויים בבעלי חיים ובבני אדם.
