הפרוטוקול שלנו מתאר את השימוש בביוזנסור מי חמצן בנוירונים וזחלים של דגי זברה בתרבית. פרוטוקול זה יסייע לחוקרים לנתח את תפקידם של מיני חמצן תגובתי בפיזיולוגיה נורמלית ופתופיזיולוגיה. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא זיהוי בזמן אמת של מי חמצן בבעלי חיים ותאים תרבותיים.
שיטה זו יכולה להיות מיושמת על בעלי חיים אחרים, כמו מערכת מודל מכרסמים. כדי להכין את ה-coverslips, יש להשתמש בכיסויים מנוקים בחומצה המאוחסנים ב-100% אתנול. השתמש מלקחיים כדי להסיר כיסוי אחד ממכל האחסון, ולהצית אותו כדי להסיר אתנול שיורית.
אוויר לייבש את הכיסוי לחלוטין על ידי הצבת אותו בזווית בתוך צלחת תרבות 35 מילימטר. הכן פולי-די-ליבין או PDL, או פתרון עבודה. החל PDL למרכז של כל coverslip, הימנעות התפשטות של הפתרון לקצוות דגירה PDL במשך 20 עד 30 דקות בטמפרטורת החדר.
ודא PDL לא להתייבש. לשטוף את PDL עם 0.5 מיליליטר של מים סטריליים ולתת את הצלחות להתייבש לחלוטין. הכן פתרון עבודה למין.
ולהחיל אותו על המרכז של כל coverslip, הקפדה למנוע את התפשטות הפתרון לקצוות. דגירה הצלחות ב 37 מעלות צלזיוס באינקובטור לח במשך שעתיים עד שש שעות, למנוע ייבוש של תמיסת למין. כדי לבצע ניתוח עובר בתאי גנגליון רשתית צלחת או RGCs, להכין ולתייג ארבע מנות תרבית רקמה 35 מילימטר ולמלא אותם עם ארבעה מיליליטר של 70% אתנול.
E2 מדיה אחת. E2 מדיה שתיים. ותקשורת E2 שלוש, ביום הניתוח.
שמור את הכלים במקרר. כאשר עוברי זברה הם 34 שעות לאחר ההפריה, לקחת את מנות התרבות מצופה למינצין מתוך האינקובטור. ולשטוף את החלקות הכיסוי שלוש פעמים עם 0.5 מיליליטר של 1X PBS.
לאחר הכביסה הסופית, מוסיפים ארבעה מיליליטר של ZFCM + מדיה לכל צלחת תרבות. הימנע ייבוש הצלחת. מחזירים את מנות התרבות בקירור המוכנות ומניחים להן להשתוות לטמפרטורת החדר.
מלא ארבעה עד שישה צינורות PCR עם 15 מיקרוליטרים של ZFCM + מדיה. לאחזר עוברי זברה מן האינקובטור לטבול עוברים בצלחת תרבית רקמה 35 מילימטר המכיל 70% אתנול במשך 5-10 שניות כדי לעקר אותו. באמצעות העברה של פיפטה, להעביר עוברים E2 מדיה מנה אחת, המכיל מדיה סטרילית E2 לשטוף אתנול עודף.
לאחר מכן, להעביר את העוברים ל E2 מדיה שתי צלחת ולהסיר chorions שלהם עם מלקחיים חדים. לבסוף, להעביר עוברים E2 מדיה שלוש צלחת לבצע ניתוחים. באמצעות זוג מלקחיים עדינים, למקם ולהחזיק עוברים לפני החלמון עם אחד המלקחיים.
ולהסיר את הזנב האחורי לשק החלמון עם המלקחיים האחרים. תפוס את הצוואר עם מלקחיים ולהוריד את הראש כדי לחשוף את המוח והעיניים למדיה E2. עם קצה של מלקחיים עדינים, בעדינות לגלגל את העיניים מהראש תוך החזקת רקמת הגולגולת למטה עם מלקחיים שניים.
העבר ארבע עיניים לאחד הצינורות שהוכנו בעבר המכיל ZFCM + בעדינות triturate למעלה ולמטה עם p20 פיפטה על 45 פעמים כדי לנתק תאים. העבר את ה- ZFCM+ עם התאים המנותקים למרכז ה- coverslips. לשמור על תרבויות על הספסל העליון ב 22 מעלות צלזיוס על מתלה קצף פוליסטירן לספוג תנודות.
ביום ההדמיה, בדוק תאים מתחת למיקרוסקופ כדי לאמת את הצמיחה של אקסונים RGC. להדמיית תאים חיים, העבירו את הכיסויים מתבשיל התרבות לתא הדמיה של תא חי. השתמש במיקרוסקופ הפוך המצויד במסנן אדום OG-590 Longpass אובייקטיבי DIC ומצלמת EMCCD.
לפני ההדמיה, החלף את ZFCM + בינוני עם ZFCM-לאחר מיקום התאים עם המטרה 10X, לרכוש תמונות בהגדלה 60X באמצעות מטרת טבילה בשמן. השתמש בהגדלה נוספת של פי 1.5. ראשית לרכוש תמונות DIC.
לאחר מכן, תמונה roGFP2-Orp1, באמצעות ערכת המסננים המתאימה. לאחר לקיחת הסט הראשון של תמונות, להחליף מדיה עם מדיה המכילה פתרונות טיפול שונים. יש לשנות את המדיה כל 30 דקות של הדמיה כדי למנוע שינויי pH ו- osmolarity.
להדמיית vivo, יש לשמור על עוברים לאחר הפריה 22 עד 24 שעות במדיה E3, המכילים 0.003% פניל תיוראה ללא כחול מתילן. להחליף מדיה ולהסיר עוברים מתים מדי יום. בגיל הרצוי, הרדמה והרה עוברים ב 1%agarose על 35 מילימטר זכוכית התחתון מנות תרבות.
עוברים יכולים להיות מכוונים דרך הגב, דרך הפה, או לרוחב, בהתאם לאזור העניין להדמיה. לאחר שהאגרוז מתגבש, ממלאים את הכלים במדיית E3 ללא מתילן כחול, אך עם 0.016% טריקאין. הגדר את המיקרוסקופ להדמיה.
השתמש במיקרוסקופ קונפוקל סריקת לייזר הפוך כדי לדמות עוברים המותקנים בתחתית טיפת אגרוז. לרגש roGFP2-Orp1, ולרכוש תמונות תואמות עם מסנני הפליטה הרצויים. לרכוש z-ערימות עם עובי סעיף חמישה מיקרו מטר דרך החלק הרצוי של העוברים.
לאחר ההדמיה, להסיר עוברים מ Agarose עם מלקחיים עדינים ולשמור אותם באינקובטור ומתילן כחול מדיה חופשית עם פניל thiourea עד הגיל הרצוי. תמונה מייצגת של ביוסנסור מי חמצן ואקסונים מורחבים של דגי זברה RGC בתרבית מוצגת כאן. גוף התא, האקסון וקונוסי הגדילה נראים בבירור בנוירונים בודדים.
התוספת של מי חמצן למדיה התרבותית מגדילה את ערכי היחס, מראה כי שינויים בזמן אמת ניתן לזהות עם מערכת זו. כימות של רמות מי חמצן מוצג בפאנל B.To לקבוע את רמות מי חמצן בעוברים זברה שלמים, mRNA הוזרק במהלך שלב התא אחד, גורם לכל הרקמות לבטא את biosensor roGFP2-Orp1. האזור הראשי של זחלי זברה מוצג בשתי נקודות זמן שונות, תוך התמקדות ברמות מי חמצן ברשתית.
רמות הבסיס של מי חמצן בעוברים של דגי הזברה ביומיים שלאחר ההפריה וחמישה ימים לאחר ההפריה נמדדו. ביומיים שלאחר ההפריה, ערכי היחס היו נמוכים משמעותית מחמישה ימים לאחר ההפריה. יתר על כן, כל בעל חיים הראה רמה שונה של עלייה בתכולת מי חמצן הרשתית שלהם.
שימוש במלקחיים עדינים להסרת העיניים ניתוק עדין של העיניים עם פיפטה הם הצעדים הקריטיים ביותר בהליך זה. פרוטוקול זה יכול להיות מלווה על ידי טיפולים תרופתיים כדי לחקור את הגורמים המעורבים איתות ROS.
