שילוב ממוטב של אנלוגים לחומצת שומן אלקיניל לגילוי חלבונים אצטט שומניים באמצעות כימיה קליק

שיטה זו משפרת את המסירה של חומצות שומן לתאים ומגנה עליהם מפני ההשפעות הרעילות של אספקת חומצות שומן חופשיות, ובכך מבטיחה תיוג עקבי יותר. הרגישות והיעילות של זיהוי כימיית קליקים תלויות בספיגה היעילה של תווית חומצת השומן. הראינו שניתן לשפר זאת במידה רבה.

מספר שלבים של הפרוטוקול הם ספציפיים מאוד ויש לעקוב אחריהם מקרוב. הדגמה חזותית יכולה להבהיר ולהראות, למשל, כיצד להימנע מהיווצרות מוצקים בתמהיל התוויות. כדי להכין את מדיה תיוג, להשלים DMEM עם 5% dextran / פחם מצופה FBS, 1X פניצילין סטרפטומיצין, שני מילימולרי L-גלוטמין, ו 100 מילימולרי נתרן פירובט, ולאחר מכן לפני לחמם אותו ל 37 מעלות צלזיוס לפני השימוש.

שטפו בעדינות את תאי ה-T של HEK-293 שציפו יום אחד קודם לכן בצלחת תרבית של שש בארות רקמות עם PBS, ולאחר מכן החליפו את ה-PBS במדיה עם תיוג. לדגור על התאים ב 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני במשך כ 45 דקות לפני שתמשיך תיוג מטבולי עם חומצות שומן. כדי saponify אנלוגים חומצת שומן, פיפטה לפחות שני microliters של חומצת שומן אלקיניל אנלוגי ישירות לתחתית בקבוקון תגובה חרוטית שלושה מיליליטר.

פיפטה כמות שווה של אשלגן הידרוקסיד מדולל קרוב לתחתית בקבוקון התגובה על קצה הזכוכית, כך נפח מחולק של אשלגן הידרוקסיד מתערבב עם חומצת השומן. סגור את המכסה של הבקבוקון והקש בעדינות כדי לערבב את הפתרונות. מחממים את בקבוקון התגובה ב 65 מעלות צלזיוס במשך כחמש דקות או עד הפתרון מתבהר, המציין כי חומצת השומן שולבה.

עם זאת, יש לדאוג כי הנוזל אינו מתאדה יותר מדי. לאחר מכן, פיפטה התחמם מראש 20% חומצות שומן ללא BSA כך יחס נפח של חומצות שומן אשלגן הידרוקסיד כדי BSA ללא חומצות שומן הוא 1-1-50, השגת ריכוז סופי של 20X חומצות שומן אלקיניל קשורות BSA. מערבבים את התמיסה על ידי צנרת למעלה ולמטה, ולאחר מכן לדגור אותו במשך 15 דקות ב 37 מעלות צלזיוס.

תייג את תאי ה-T של HEK-293 על-ידי הוספת חומצת השומן BSA 20X מצומדת ישירות למדיית הרעב כדי להשיג ריכוז סופי של 1%BSA ב-25 מיקרומולרי אלקיניל מיריסטט או 100 מיקרומולרי אלקיניל פלמיטט ואלקיניל סטארט. לשם השוואה, להוסיף נוזלים שאינם saponified על ידי צינור שני microliters של חומצת שומן ללא תווית ישירות לתוך התקשורת רעב, ולאחר מכן למקם את התאים בחזרה לתוך האינקובטור במשך שלוש עד שש שעות. לאחר השלמת הדגירה, לשטוף בעדינות את התאים עם PBS בטמפרטורת החדר, ולאחר מכן לקצור וליז את התאים על ידי הוספת 500 microliters EDTA חינם שונה מאגר RIPA וסיבוב lysates במשך 15 דקות בארבע מעלות צלזיוס.

צנטריפוגה lysates ב 16, 000 כפול G במשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס, ולאחר מכן לאסוף את supernatant ב 1.7 מיליליטר צינורות microcentrifuge ולאחסן אותם במינוס 20 מעלות צלזיוס. הביאו 50 עד 100 מיקרוגרם של ליסט חלבון בצינורות מיקרו-צנטריפוגות של 1.7 מיליליטר לנפח שווה באמצעות מאגר RIPA שונה ללא EDTA. שמור על עוצמת התגובה קטנה ככל האפשר.

הוסף STS לכל דגימה כדי להשיג ריכוז סופי של 1%הכן תערובת ראשית של ריאגנטים קליקים והוסף אמצעי אחסון מתאימים לליסטים, ולאחר מכן ערבוב על-ידי צנרת למעלה ולמטה. לדגור על lysates בחושך במשך 30 דקות באמבט מים 37 מעלות צלזיוס עם ערבוב מדי פעם. עבור immunoprecipitation, לערבב lysates עם ארנב אנטי GFP ודגור לילה עם סיבוב בארבע מעלות צלזיוס.

הוסף 15 עד 20 מיקרוליטרים של חרוזים מגנטיים מראש שיווי משקל עם 0.1% SDS RIPA לכל צינור ולאפשר לו להגיב סוף סוף בארבע מעלות צלזיוס במשך שלוש שעות. לשטוף את החרוזים עם מאגר תמוגה resuspend ב 45 microliters של 50 מילימולר HEPES חיץ המכיל 1%SDS. מחממים את החרוזים ב 80 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות.

במהלך הדגירה, להפוך או להסעיר את הצינורות בערך כל חמש דקות, ואז לסובב בקצרה את כל הצינורות. בעוד הדגימות עדיין חמות, לאסוף את supernatant המכיל את החלבונים. שלבו 43 מיקרוליטרים של הסופר-נרטיב עם שבעה מיקרוליטרים של תערובת מאסטר ריאגנטים קליקים ואפשרו להם להגיב בחושך במשך 30 דקות ב-37 מעלות צלזיוס.

בעלילה מערבית, נצפתה השפעה ניכרת ביעילות התיוג לגילוי כימיה קליק בין חומצות שומן אלקיניל סאפוניזציה ולא סאפון עם אורך הולך וגדל של שרשראות אציל. בתאים המסומנים עם אלקיניל סטארט, סאפוניפיקציה של חומצת השומן ואספקה עם BSA עבור תיוג מטבולי הגדיל באופן דרסטי את הזיהוי של אות חלבון S-acylated באמצעות כימיה קליק וזיהוי על ידי azitoprobe פלואורסצנטי, מציע עלייה כוללת שילוב תאי של תווית חומצת השומן אלקיניל. לעומת זאת, לא נצפתה הבדל ניכר בתאים שטופלו בחומצת השומן הקצרה והמסיסה ביותר אלקיניל מיריסטט.

תאים המסומנים באלקיניל פלמיטט הראו עלייה בינונית בתווית בהשוואה לאלקיניל מיריסטט, אך פחות מאלקיניל סטארט. חשוב לציין, טיפול של ממברנות PVDF עם 0.1 טוחנת אשלגן הידרוקסיד הסיר במידה רבה את תוויות חומצת השומן מתאים דגירה עם אלקיניל פלמיטט ואת אלקיניל סטארט, המאשר כי רוב האות היה באמצעות קשר אסתר או thioester. כצפוי, השילוב של אלקיניל מיריסטט היה בעיקר אלקלי עמיד בשל הקשר של myristate לחלבונים באמצעות קשר אמיד.

בעקבות כימיה קליק, myristoylation של סוג פראי myristoylated C-מסוף הנטינגטון GFP זוהה immunoprecipitates, כמו גם lysates, בעוד מוטציית G2A חסמה לחלוטין מיריסטוylation של C-מסוף הנטינגטון GFP. בעקבות כימיה קליק, אנו יכולים לבצע טיהור זיקה של חלבונים acylated שומן עבור ספקטרומטריית מסה. זה עשוי להניב פרופיל שונה של חלבונים acylated שומן על ידי הגנה על תאים מפני רעילות.