המחברים מודים לגברת לורדס קאריון ג'י טאן על עזרתה בבעלות הדגים. עבודה זו מומנה על ידי NMBU, מענקים בסיוע מהחברה היפנית לקידום המדע (JSPS) (מענק מספר 18H04881 ו- 18K19323), ומענק לפרויקטים בסיסיים לחקר המדע מקרן סומיטומו ל- S.K.

כל הניסויים והטיפול בבעלי חיים נערכו בהתאם להמלצות על רווחת בעלי החיים הניסיונית באוניברסיטה הנורבגית למדעי החיים. ניסויים באמצעות כריתת גונדקטומיה אושרו על ידי הרשות הנורבגית לבטיחות מזון (FOTS ID 24305).
הערה: הניסויים בוצעו באמצעות זכר ונקבה בוגרים (6-7 חודשים, משקל כ 0.35 גרם, אורך כ 2.7 ס"מ) Medaka יפני. המין נקבע על ידי הבחנה המאפיינים המיניים המשניים, כגון גודל וצורה של סנפיר גב ואנאלי, כמתוארב 42,47.
1. הכנת מכשירים ופתרונות
<ol><li>הכן פתרון מלאי הרדמה (0.6% טריקיין).<ol>
<li>לדלל 0.6 גרם של Tricaine (MS-222) ב 100 מ"ל של 10x פוספט חוצץ מלוח (PBS).</li>
		<li>להפיץ 1 מ"ל של פתרון מלאי Tricaine לתוך כמה צינורות פלסטיק 1.5 מ"ל ולאחסן ב -20 °C (70 °F) עד לשימוש.</li>
	</ol>
</li>
	<li>הכן מי התאוששות (0.9% פתרון NaCl) על ידי הוספת 18 גרם של NaCl לתוך 2 ליטר של מים באקווריום. יש לאחסן את הפתרון בטמפרטורת החדר עד לשימוש.</li>
	<li>הכן את כלי החתך על ידי שבירת סכין גילוח באלכסון כדי לקבל נקודה חדה(איור 1A).</li>
	<li>הכן פתרון נוגד קרישה בדם (0.05 U/μL של נתרן הפרין) על ידי דילול 25 μL של נתרן הפרין לתוך 500 μL של 1x PBS. יש לאחסן את הפתרון נוגד קרישה ב-4 מעלות צלזיוס עד לשימוש.</li>
	<li>הכן שתי מחטי זכוכית מזכוכית באורך 90 מ"מ על ידי משיכת נימי זכוכית עם מושך מחטים (איור 1B) בהתאם להוראות היצרן. הערה: הקוטר החיצוני של מחט הזכוכית הוא 1 מ"מ, בעוד הקוטר הפנימי הוא 0.6 מ"מ.</li>
	<li>הכן מכסה צינור פלסטיק בגודל 1.5 מ"ל על ידי חיתוך המכסה ובצע חור שמתאים לקוטר החיצוני של המחט(איור 1C). כדי להפוך את החור, לחמם קצה אחד של נימי זכוכית 9 מ"מ ולדקור את נימי הזכוכית מחומם דרך המכסה. לחלופין, להשתמש במחט כדי לדקור דרך המכסה עד קוטר החור מתאים עם נימי זכוכית 9 מ"מ.</li>
</ol>2. הליך כריתת גונדקטומיה
<ol><li>הכן 0.02% של פתרון הרדמה על ידי דילול צינור אחד של מניות Tricaine (0.6%) ב 30 מ"ל של מים אקווריום.</li>
	<li>הכן כלי ניתוח כולל מלקחיים דקים במיוחד ושני מלקחיים עדינים (אחד עם קצה רחב יחסית), מספריים קטנים, חוט ניילון ותער כמתואר בשלב 1.3.</li>
	<li>מרדים את הדג על ידי הכנסתו לתמיסת הרדמה של 0.02% למשך 30-60 שניות. הערה: משך ההרדמה תלוי בגודל ובמשקל של הדג ויש להתאים אותו. כדי להבטיח כי הדג הוא מרדים לחלוטין, גוף הדג ניתן לצבוט בעדינות באמצעות מלקחיים. אם הדג לא מגיב, ניתן להתחיל את כריתת הגונדקטומיה.</li>
	<li>מוציאים את הדגים מהתמיסה ההרדמה ומניחים את הדג אופקית על צידו, מחוץ למים תחת מיקרוסקופ הרדמה.</li>
	<li>כריתת אובלות (OVX) אצל נקבות<ol>
<li>יש להסיר ביצים (ביצים התלויות מחוץ לגוף הנקבה) אם בכלל ולגרד את המאזניים באזור החתכים(איור 2A).</li>
		<li>יש לבצע בעדינות חתך באורך של כ-2-2.5 מ"מ בין הצלעות, בין הסנפירים האגן לאנאלי(איור 2A),באמצעות סכין הגילוח. לאחר מכן, לצבוט בעדינות את הבטן דגים תוך לקיחת השחלות לאט לאט באמצעות מלקחיים עדינים עם קצה רחב.</li>
		<li>חותכים את קצה השחלות באמצעות מלקחיים עדינים ומניחים את השחלות בצד(איור 2B). הערה: יש להקפיד לא לשבור את שק השחלות במידת האפשר. אם שק השחלות שבור, הסר כל עקבות gonad לחלוטין ככל האפשר מבלי להשאיר אפילו כל ביצים שאינן ביוץ.</li>
	</ol></li>
	<li>כריתת סחלב אצל זכרים<ol>
<li>יש לבצע בעדינות חתוך בין הצלעות שמעל פי הטבעת (איור 2A), ולפתוח את החתירה באיטיות באמצעות מלקחיים עדינים.</li>
		<li>תפסו בעדינות את האשכים באמצעות המלקחיים העדינים ואיטיות הוציאו את האשכים. לאחר מכן, חתכו את קצה האשכים כדי להסיר לחלוטין את האשכים (איור 2B). לכריתת סחלבים זכרים, כל ההכנות דומות לנקבות עד לחלק ההחתכה. כאשר תופסים את האשכים, לפעמים השומן הדומה האשכים מתקבל. עם זאת, לאחר שחזור השומן, ניתן לנסות למצוא את האשכים שוב (איור 2B). הערה: הן עבור זכרים והן עבור נקבות, חשוב למזער את גודל ההסתה בבטן כדי למנוע נזק מוגזם שיכול להוביל לתמותה. לפעמים המעיים עשויים להופיע גם דרך ההסתעפות יחד עם הגונדים, כדי לוודא שהם מוחזרים כראוי בתוך ההסתעפות לפני הסגירה. ידע מוקדם על השחלות ומיקום האשכים בבטן מדאקה הוא חיוני.</li>
	</ol></li>
	<li>לתבל את החתירה באופן דומה אצל זכרים ונקבות(איור 3).<ol>
<li>מניחים את חוט הניילון ליד אזור ההשתכה ודוקרים את העור מצד ימין של ההשתכה דרך חלל הגוף הפנימי באמצעות מלקחיים עדינים במיוחד כדי לקחת את החוט במלקחיים עדינים (איור 3;1-2).</li>
		<li>דקרו את העור מצד שמאל של ההסתעפות דרך חלל הגוף החיצוני כדי להוציא את החוט (איור 3;3-4).</li>
		<li>סגור את פתח החתך ובצע שני קשרים וחתוך את החוט המוגזם (איור 3;4-6). הערה: התפר חייב להיות הדוק כראוי, ואת החוט הנותר על הדג חייב להיות ארוך מספיק כדי למנוע התרופפות של התפר. כל ההליך מהרדמה עד תפירה בדרך כלל לוקח עד 6 דקות. זמן רב יותר עלול להוביל לתמותה.</li>
		<li>שים את הדגים במי ההתאוששות ולהשאיר אותם לפחות 24 שעות לפני העברתם למערכת האקווריום. הערה: דג Gonadectomized בדרך כלל להראות התנהגות נורמלית לאחר 1-2 שעות במי ההתאוששות. לכן, בהתאם למטרת הניסוי, ניתן לדגום את הדגים לאחר מרווח זמן זה.</li>
	</ol></li>
</ol>3. הליך דגימת דם
<ol><li>הכן את הכלים: מחט זכוכית, נימי סיליקון, צינור פלסטיק עם חור, צינור פלסטיק ריק 1.5 מ"ל, מיני צנטריפוגה וסרט הדבקה.</li>
	<li>יש להעשיר את הדגים באמצעות פתרון הרדמה של 0.02% כמתואר בשלב 2.1 ולהניח את הדגים מתחת למיקרוסקופ ניתוח במיקום אנכי (איור 4A). מניחים את הדג על משטח בהיר כדי להקל על ההדמיה של וריד הדקירה.</li>
	<li>התקן את מגירת הדם על ידי חיבור מחט זכוכית לנופלרי הסיליקון(איור 4B). לשבור את קצה המחט עם מלקחיים קצה רחב וציפוי החלק הפנימי של המחט עם פתרון נוגד קרישה על ידי שאיבה ופיצוץ. הערה: השימוש של פראייר נימי סיליקון עם אורך של לפחות 50 ס"מ מומלץ לאמצעי בטיחות כדי למנוע כל מגע ישיר של הדם בעת שאיבה. בנוסף, ודא כי פתיחת קצה המחט הוא גדול מספיק כדי לאפשר ציור הדם.</li>
	<li>כוון את המחט לכיוון אזור הדו-פדנקל של הדג, כוון לווריד הדו-פדונקל(איור 5A)ומשוך את הדם באמצעות הפה עד שלפחות רבע מהנפח הכולל של המחט יתמלא (איור 5B). הערה: חשוב להפסיק לניקה לפני הסרת המחט מגוף הדג.</li>
	<li>שחרר את המחט ולשים חתיכת קלטת בסמיכות של הצד החד של המחט. הניחו את המכסה עם חור בצינור איסוף והכניסו את המחט לתוך הצינור דרך החור עם קצה המחט מבחוץ(איור 5C).</li>
	<li>שים את הדגים במי ההתאוששות ולהשאיר אותם לפחות 24 שעות לפני העברתם למערכת האקווריום. הערה: כדי לבצע דגימת דם שנייה מאותו דג, לדגום את הדם שבוע לאחר דגימת הדם הראשונה.</li>
	<li>פלאש לסובב את הדם שנאסף במשך 1-2 שניות עם 1,000 x גרם בטמפרטורת החדר כדי לאסוף את הדם בצינור.</li>
	<li>המשך ישירות ליישומים במורד הזרם או לאחסן את הדם ב -20 °C (70 °F) עד לשימוש. הערה: עיין במחקר הקודם עבור מיצוי סטרואידים סקס מכל הדם48.</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

כפי שדווח בספרות קודמת, gonadectomy ודגימה דם שימשו זמן רב במינים מודל אחרים כדי לחקור שאלות הקשורות לתפקיד של סטרואידים מיניים ברגולציה של ציר BPG. עם זאת, טכניקות אלה נראה מקובל רק עבור בעלי חיים גדולים יותר. בהתחשב בגודל הקטן של מודל הטלוסט הנפוץ, medaka יפנית, אנו מספקים פרוטוקול מפורט עבור gonadectomy ודגימה דם כי הוא אפשרי עבור מין זה.
העובדה ששיעור ההישרדות של דגי גונדקטומיים הגיע כמעט ל -100% מצביעה על כך שניתן ליישם את הליך כריתת הגונדקטומיה על מדאקה. באופן דומה, הליך דגימת הדם אינו משפיע על שרידות הדג כפי שמוצג על ידי שיעור ההישרדות של 100% לאחר שעבר הליך זה. בנוסף, נקבות המופעלות בזיוף שגדלו יחד עם זכרים המופעלים בשאפתן מראות אופוזיציה וביציות מופרות ב -100%, מה שמצביע על כך שהליך החתירה והתפר אינם משפיעים על רביית הדגים. במילים אחרות, הם היו בריאים מספיק כדי להשריץ. יתר על כן, דגים חלקית gonadectomized להראות ריכוזים דומים של סטרואידים מיני לדגים המופעלים בזיוף, ו oviposition אצל כמה נקבות, כמו גם הפריה של ביצים על ידי זכרים נצפו אלה דגים גונדקטומיים חלקית. תוצאות אלה מציעות כי ההליך של gonadectomy צריך להתבצע בדיוק גבוה, כלומר השחלות או האשכים צריך להיות מוסר לחלוטין.
כפי שניתן לראות באיור 8, סימן החתירה והתפירה על הדגים נעלם לחלוטין 4 שבועות לאחר כריתת הגונדקטומיה, והדגים עדיין חיים ונראים בריאים 4 חודשים לאחר הניתוח. אלה מצביעים על כך שהליך הפעולה בטוח לדגים למטרה ארוכת טווח ואינו משפיע על תוחלת החיים של הדגים. בנוסף, לאחר 4 חודשים, לא נצפו נדות. זה מאושר על ידי רמות נמוכות של E2 ו 11-KT כי הם עדיין דומים לאלה שנמצאו דגים gonadectomized לאחר 24 שעות.
רמות E2 ו-11-KT בדגים בגונדקטומיה נמוכות משמעותית מדגים המופעלים בשאפתן, כבר לאחר 24 שעות לאחר כריתת הגונדקט ונשארות נמוכות יותר בדגים שנדגמו 4 חודשים לאחר כריתת הגונדקטומיה. רמות סטרואידים המין נמוכות משמעותית דגים gonadectomized לעומת שליטה נצפו במחקרים קודמים דג37, שפמנון39 ו medaka48. עדויות עקביות אלה מצביעות על כך הליך כריתת הגונדקטומיה המתואר בפרוטוקול היא טכניקה אמינה כדי לנקות סטרואידים סקס במחזור.
מאז הליך זה אינו מסתמך על FADS כפי שהוכח ב40, gonadectomy צריך להתבצע מהר ככל האפשר כדי למנוע תמותה במהלך הניתוח. ואכן, השימוש ב- FADS מאפשר לשמור על קצב הפעולה שכן כלי זה מאפשר מצב הרדמה מתמשך לדגים למרות שהוא נחשף לאוויר. עם זאת, בשל ההיתכנות הנמוכה יותר שלה בטלוסט הקטן כמו medaka, השימוש FADS לא יכול להתבצע עם גודל כזה של דגים. בנוסף, בניגוד לפרוטוקול הגונדקטומיה הקודם בדגים גדולים יותר המאפשר זעזוע רחב להגיע לגונד, הפרוטוקול המתואר בכתב יד זה אינו מאפשר חדירה רחבה כדי למנוע נזק מוגזם לדגים הקטנים. לכן, יש להיזהר מאוד כאשר מנסים לגשת gonad באמצעות מלקחיים כדי למנוע נזק ברקמות אחרות בתוך חלל גוף הדג.
הפרוטוקול מסתמך על הליך מהיר ונקי. לכן מומלץ מאוד לאמן עד להגעה לשיעור הצלחה גבוה, המצוין על ידי שיעור הישרדות גבוה של הדגים לאחר כריתת הגונדקטומיה, כמו גם הסרה מלאה של הגונדים (ראו את ההבדל במראה המורפולוגי והאנטומי של הדג לפני ואחרי כריתת גונדקטומיה מוצלחת באיור 7). למעשה, גורמים רבים יכולים להשפיע על שיעור ההצלחה של ההליך, כולל תקופת ההרדמה, הרחבה של החתירה, הדיוק והסידרות של התפר וטיפול בדגים במהלך ההליך. נקודה חשובה נוספת היא כי יש להכין דגים בריאים על ידי שמירה על הדג בצורה אופטימלית לפני ביצוע הפרוטוקול.
לגבי הליך דגימת הדם, המחקרים הקודמים ניסו לדגום את הדם מדאקה48 ודג זברה49,50,51, אבל ההליך אינו מאפשר דגימת דם חוזרת באותו דגים מאז הדם נלקח לאחר המתת חסד את הדג. דגימת דם חוזרת הודגמה באמצעות דגי זברה במחקר אחר52, אבל אנחנו מדווחים על סוג זה של פרוטוקול בפעם הראשונה medaka.
ההערכה של ריכוזי סטרואידים מיני מתבצעת בדרך כלל באמצעות ערכת חיסון הקשורה אנזים (ELISA), והיו ערכות ELISA רבות זמין מסחרית עבור סוגים שונים של סטרואידים מין. בשל כמות הדם הנמוכה שנאספה במהלך דגימת הדם, בדיקות במורד הזרם מיועדות לכל הדם. מחקרים קודמים הראו כי יש הבדל ברמה הנמדדת של רמות סטרואידים במחזור שחולצו מדם שלם ופלזמה53,54. לכן, ההבדל ברמות סטרואידים המין מדם שלם ופלזמה צריך להיות מאומת לפני ביצוע הניסוי האמיתי באמצעות הפרוטוקול.
כפי שתועד במחקרים קודמים עם מודלים שונים של בעלי חיים, הפרוטוקול המתואר כאן יאפשר לחקור שאלות הקשורות לפיזיולוגיה של הרבייה באמצעות טלוסט בגודל קטן כמודל. למעשה, טכניקות אלה כבר תרמו לענות על שאלות הנוגעות לרגולציה של ציר BPG ומנגנוני המשוב שלו, כגון מעורבות של kiss1 (סוג גן kisspeptin 1) המבטאים נוירונים בלולאות משוב חיוביות55, רגולציה בתיווך אסטרוגן של kiss1 המבטאת נוירונים בגרעין גנאליס tuberis (NVT), ו kiss2 (kisspeptin סוג 2) מבטא נוירונים באזור טרוםoptic (POA)56, 57, המעורבות האפשרית של קולטן אסטרוגן β1 (Esr2a) ברמת ביטוי fsh מווסת למטה בנקבה יפנית medaka58, כמו גם את הפרופיל של השעון הביולוגי של E2 בדגיםנקבה 48. יתר על כן, מאז מחקרים קודמים הראו כי סטרואידים מיניים משפיעים גם על התפשטות של תאי גונדוטרופים בבלוטת יותרת המוח של teleosts59,60, זה מסקרן לחקור את ההשפעות של שחרור סטרואידים מיני לאחר כריתת בלוטת יותרת המוח על פלסטיות יותרת המוח.
טכניקת דגימת הדם לא רק יכול לשמש לניתוח סטרואידים סקס, אלא גם לניתוח תוכן דם אחר, כולל רמות הגלוקוז בדם. ואכן, הפרוטוקול יכול להיות מיושם גם למדידות גלוקוז בדם כפי שהוכח דג זברה52 ו medaka61. לכן, ניתן להרחיב טכניקה זו כדי לטפל בשאלות מחקר בתחומים אחרים של פיזיולוגיה.
לבסוף, הפרוטוקולים המתוארים כאן מיועדים ומותאמות עבור medaka יפנית למבוגרים, ואת התוצאות בשל גודל שונה של דגים וחומרים המשמשים במהלך ההליכים עשוי להשתנות. יתר על כן, כמו medaka שמאל וימין שחלות / האשכים מותכים, אשר עשוי לספק יתרון חשוב עבור gonadectomy, פרוטוקול זה עשוי להזדקק מספר התאמות לפני השימוש במינים אחרים שבו זה לא המקרה כגון דגי זברה. לכן, יש לקחת בחשבון אופטימיזציה על פי בחירת ציוד מעבדה וגודל דגים לפני בדיקת פרוטוקולים אלה.

בחולייתנים, סטרואידים מיניים, אשר מיוצרים בעיקר על ידי gonads, לשחק תפקידים חשובים ברגולציה של המוח-יותרת המוח-Gonadal (BPG) ציר באמצעות מנגנוני משוב שונים1,2,3,4,5. בנוסף, סטרואידים מיניים משפיעים על התפשטות ופעילות של נוירונים במוח6,7,8 ותאים אנדוקריניים, כולל גונדוטרופים, בבלוטת יותרת המוח9,10, ובכך משרתים תפקידים מכריעים בפלסטיות המוח ובלוטות יותרת המוח. למרות ידע טוב יחסית ביונקים, המנגנון של ויסות ציר BPG בתיווך סטרואידים מיניים רחוק מלהיות מובן במינים שאינם יונקים, מה שמוביל להבנה לקויה של עקרונות שמורים אבולוציוניים11. יש עדיין מספר מוגבל של מחקרים המתעדים את התפקיד של סטרואידים מיניים על המוח ופלסטיות יותרת המוח, ובכך להעלות את הצורך בחקירות נוספות של התפקיד וההשפעות של סטרואידים מיניים על מינים בעלי חוליות מגוונים.
בקרב בעלי חוליות, teleosts הפכו חיות מודל חזקות בטיפול בשאלות ביולוגיות ופיזיולוגיות רבות, כולל תגובת מתח12,13, צמיחה14,15, פיזיולוגיה תזונתית16,17 ורבייה2. Teleosts, שבו סטרואידים מיני מיוצגים בעיקר על ידי אסטרדיול (E2) אצל נקבות ו 11-ketotestosterone (11-KT) אצל זכרים18,19, כבר זמן רב מודלים ניסיוניים אמינים לחקור את העיקרון הכללי של רבייה על פני מינים. Teleosts להראות ייחודיות שלהם חיבור ההיפותלמוס-יותרת המוח20,21 ותאי גונדוטרופים נפרדים22, אשר לפעמים נוחים להבהרת מנגנונים רגולטוריים. יתר על כן, בשל נוחותם הן לניסויי מעבדה והן לניסויים בשטח, טלוסטים מציעים יתרונות רבים בהשוואה לאורגניזמים אחרים. הם זולים יחסית לרכוש ולתחזק23,24. בפרט, מודלים טלוסט קטנים כגון דגיזברה (דניו rerio) ואת medaka היפני (Oryzias latipes),הם מינים עם פוריות גבוהה מאוד ומחזור חיים קצר יחסית המאפשר ניתוח מהיר של תפקוד גנים ומנגנוני מחלות23,ובכך מספק יתרונות גדולים עוד יותר בטיפול בשפע של שאלות ביולוגיות ופיזיולוגיות, בהתחשב בפרוטוקולים המפותחים הרבים וארגז הכלים הגנטי הזמין למינים אלה25.
במחקרים רבים, הסרת gonads (gonadectomy) יחד עם טכניקות דגימת דם שימשו כשיטה לחקור שאלות פיזיולוגיות רבות, כולל השפעתה על פיזיולוגיה של פוריות חוליות ביונקים26,27,28, ציפורים29 ודו חיים30. למרות ההשפעה gonadectomy על פיזיולוגיה הרבייה יכול להיות לחילופין החיות על ידי אנטגוניסטים סטרואידים מין, כגון טמוקסיפן ו clomiphene, ההשפעה של התרופות נראה לא עקבי עקב השפעות bimodal31,32. חשיפה כרונית אנטגוניסט סטרואידים מין עלול להוביל להגדלת השחלות33,34, אשר עשוי להשבית תצפית של השפעותיו למטרות לטווח ארוך עקב פנוטיפ לא בריא. בנוסף, אי אפשר לבצע ניסוי התאוששות לאחר טיפול אנטגוניסט סטרואידים סקס, כדי להצדיק את ההשפעה הספציפית של סטרואידים מיניים מסוימים. יחד עם אלה נקודות הנ"ל, פשרות אחרות של שימוש אנטגוניסט סטרואידים סקס נבדקו בהרחבה31,32. לכן, gonadectomy עדיין מופיע היום כדכניקה רבת עוצמה לחקור את התפקיד של סטרואידים מיניים.
בעוד שטכניקות גונדכרטומיה ודגימה בדם קלות יחסית לביצוע במינים גדולים יותר, כגון בס ים אירופאי(Dicentrarchus labrax)35, ראסה ראש כחול(תלאסומה ביפסיאטום)36,דגי כלבים(Scyliorhinus)37 ושמנונים(Heteropneustes מאובנים וקלאריאס רחקוס)38,39,הם מעלים אתגרים כאשר מוחלים בדגים קטנים כמו medaka. לדוגמה, השימוש במערכת משלוח הרדמה דגים (FADS)40 הוא פחות ריאלי ונראה נוטה נזק פיזי מוגזם עבור דגים קטנים. בנוסף, הליך כריתת גונדקטומיה המשמש בדרך כלל לדגים גדולים יותר40 אינו מתאים לדגים קטנים הדורש דיוק גבוה כדי למנוע נזק מוגזם. לבסוף, דגימת דם היא מאתגרת בשל הגישה המוגבלת לכלי הדם וכמות הדם הקטנה בבעלי חיים אלה. לכן, פרוטוקול ברור המדגים כל שלב של כריתת גונדקטומיה ודגימה דם בטלוסט קטן הוא בעל חשיבות.
פרוטוקול זה מדגים את ההליכים שלב אחר שלב של כריתת גונדקטומיה ואחריו דגימת דם ב Medaka היפנית, דג מים מתוקים קטן שמקורו במזרח אסיה. Medaka היפני יש גנום רצף, כמה כלים מולקולריים וגנטיים זמינים25, ומערכת קביעת מין גנטי המאפשר לחקור הבדלים מיניים לפני מאפיינים מיניים משניים או gonads מפותחים היטב41. מעניין לציין שמדקה היפנית מחזיקה בגונדים מותכים בניגוד למינים טלוסטים רבים אחרים42. שתי טכניקות אלה יחד לקחת רק 8 דקות בסך הכל וישלים את הרשימה של פרוטוקולי וידאו כבר קיים עבור מין זה שכלל תיוג של כלי הדם43, מהדק תיקון על סעיפים יותרת המוח44 נוירונים במוח45, ותרבות תאיםראשונית 46. טכניקות אלה יאפשרו לקהילת המחקר לחקור ולהבין טוב יותר את התפקידים של סטרואידים מיניים במנגנוני משוב, כמו גם פלסטיות המוח ובלוטות יותרת המוח בעתיד.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Glass capilary</td>
			<td></td>
			<td>GD1</td>
			<td>Glass Capillary with Filament GD-1; Narishige</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin sodium salt</td>
			<td></td>
			<td>H4784-1G</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle puller</td>
			<td></td>
			<td>P97</td>
			<td>Flaming/Brown Micropipette puller Model P-97; Sutter Instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nylon thread</td>
			<td></td>
			<td>N45VL</td>
			<td>Polyamide suture, 0.2 metric; Crownjun</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic tube</td>
			<td></td>
			<td>T9661</td>
			<td>Eppendorf Safe-lock microcentifuge tube 1.5 ml, Sigma-aldrich</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor blade</td>
			<td></td>
			<td>-</td>
			<td>Astra Superior Platinum Double Edge Razor Blades Green, salonwholesale.com</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone capillary</td>
			<td></td>
			<td>a16090800ux0403</td>
			<td>Uxcell Silicone Tube 1 mm ID x 2 mm OD, amazon.com&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaine</td>
			<td></td>
			<td>WXBC9102V</td>
			<td>Aldrich chemistry</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

gonadectomy and blood sampling procedures in the small size teleost model japanese medaka (oryzias latipes)

סטרואידים סקס, המיוצר על ידי האשכים, לשחק תפקיד חיוני במוח ורקמות יותרת המוח פלסטיות, בשליטה neuroendocrine של רבייה בכל בעלי החוליות על ידי מתן משוב למוח ובלוטות יותרת המוח. דגי טלוסט מחזיקים ברמה גבוהה יותר של פלסטיות רקמות וריאציה באסטרטגיות הרבייה בהשוואה ליונקים ונראה שהם מודלים שימושיים לחקור את תפקידם של סטרואידים מיניים ואת המנגנונים שבאמצעותם הם פועלים. הסרת המקור העיקרי של ייצור סטרואידים מיני באמצעות gonadectomy יחד עם דגימת דם כדי למדוד את רמות הסטרואידים כבר מבוסס היטב למדי אפשרי דגים גדולים יותר, היא טכניקה רבת עוצמה לחקור את התפקיד וההשפעות של סטרואידים מיניים. עם זאת, טכניקות אלה מעלות אתגרים כאשר מיושמות במודלים טלוסט בגודל קטן. כאן, אנו מתארים את ההליכים שלב אחר שלב של כריתת גונדקטומיה הן אצל זכרים והן אצל נקבה יפנית מדאקה ואחריו דגימת דם. פרוטוקולים אלה מוצגים להיות אפשרי מאוד medaka המצוין על ידי שיעור הישרדות גבוה, בטיחות על תוחלת החיים ואת פנוטיפ של הדג, רבייה במונחים של אישור סטרואידים מין. השימוש בהליכים אלה בשילוב עם היתרונות האחרים של שימוש במודל טלוסט קטן זה ישפר מאוד את ההבנה של מנגנוני משוב בשליטה הנוירואנדוקרינית של רבייה ופלסטיות רקמות המסופקים על ידי סטרואידים מיניים בחולייתנים.

פרוטוקול זה מתאר כל צעד לביצוע כריתת גונדקטומיה ודגימה בדם בטלוסט מודל בגודל קטן, medaka היפני. שיעור ההישרדות של הדגים לאחר כריתת השחלות (OVX) אצל הנקבות הוא 100% (10 מתוך 10 דגים) ואילו 94% (17 מתוך 18 דגים) של הזכרים שרדו לאחר כריתת סחלב. בינתיים, לאחר שבוצע הליך דגימת הדם, שרדו כל הדגים (38 הדגים).
נקבות המופעלות על ידי שיים מראות אויביפוזיציה(איור 6A)וכל הביציות הופרו והתאפשרו להתפתחות עוברית(איור 6B). זכרים המופעלים בשאפת שמים הצליחו גם להפרות ביצים לאחר שבוע-שבועיים בלבד. שתיים מתוך שש נקבות חלקיות שגדלו עם זכרים חלקית עברו כריתה הראו גם הם אוביפוזיציה עם 100% מהביצים המופרות לאחר חודשיים. לעומת זאת, לא נצפתה נטייה אצל נקבות או הפריה על ידי זכרים בדגים בגונדקטומיה מלאה, גם לאחר 4 חודשים.
כאשר מתבצע נכון, צורת הגוף של הדג משתנה מעט (איור 7A),ושום חתיכת גונד לא צריכה להישאר לאחר הליך כריתת הגונדקטומיה(איור 7B). בינתיים, 4 שבועות לאחר כריתת הגונדקטומיה, החתירה והתפיר נעלמו לחלוטין(איור 8),ואחרי 4 חודשים, כל הדגים הגונדקטומיים עדיין הראו פנוטיפ בריא, ולא נמצאה רקמת גונדל.
ריכוזי הדם E2 אצל נקבות (טבלה 1),שנמדדו עם ELISA בעקבות הוראות היצרן, גילו כי רמת E2 בדגי OVX נמוכה משמעותית מאשר בדגים המופעלים בשאפתן 24 שעות לאחר הניתוח (p < 0.00001). לאחר 4 חודשים, רמת E2 בדגי OVX נמוכה משמעותית מאשר בדגים המופעלים בשאיפה(p < 0.00001) ולא מראה הבדל משמעותי בהשוואה לזה ב 24 שעות לאחר OVX דגים(p > 0.05). לבסוף, בחלקו דגים OVX, שבו רק 1/3 עד 1/2 של gonad הוסר, להראות רמות E2 נמוכות משמעותית מאשר דגים המופעלים בשאפתן(p = 0.0437) ורמות E2 גבוהות משמעותית מאשר דגי OVX מלאים(p < 0.00001)(איור 9A).
באופן דומה אצל גברים (טבלה 1),ריכוז 11-KT בדגים סחלבים נמוך משמעותית מאשר בדגים המופעלים בשאיפה 24 שעות לאחר הניתוח (p < 0.00001). הרמה של 11-KT בדגים סחלב לאחר 4 חודשים היא גם נמוכה משמעותית מאשר דגים המופעלים בשאפתן(p < 0.00001) ולא מראה הבדל לעומת דגים לאחר סחלב 24 שעות(עמ ' > 0.05). לבסוף, דגים בחלקם סחלבים מראים רמות נמוכות משמעותית של 11-KT מאשר דגים המופעלים בשאפתן(p = 0.0428) ורמות גבוהות משמעותית של 11-KT מאשר דגים סחלבים לחלוטין(p < 0.00001)(איור 9B).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62006/62006fig01.jpg"> איור 1. הכנת מכשיר. (א)סכין גילוח לכריתת גונדקטומיה, (B)מחט זכוכית להפקת דם, ו (C) צינור פלסטיק יחד עם מכסה עם חור לאיסוף דם. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/62006/62006fig01large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62006/62006fig02.jpg"> איור 2. מיקום אזור ההחתצה. A) ציור של אזור ההחתכה הממוקם בין הצלעות, בין סנפירי האגן והאנאלי אצל הנקבות (פאנל שמאלי) וזכרים (פאנל ימני); B) הסרת לד אצל נקבות (פאנל שמאלי) וזכרים (פאנל ימני), עיגולים לבנים המציגים את החלק המשותף, חץ לבן המציג את האשכים ואת החץ השחור מראה את השומן. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/62006/62006fig02large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62006/62006fig03.jpg"> איור 3. הליך התפר. 1) חור נעשה בצד ימין של ההסתה באמצעות מלקחיים עדינים במיוחד. 2) חוט הניילון מועבר דרך העור באמצעות החור שנעשה ב 1. .3 נעשה חור בצד שמאל של ההסתה. 4) חוט הניילון מועבר דרך החור שנעשה ב 3. 5) קשר מוגזם נעשה פעמיים כדי לסגור את ההסתבכות. 6) חוט עודף נחתך. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/62006/62006fig03large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62006/62006fig04.jpg"> איור 4. מיקום דגים במהלך דגימת דם (A), התקנת מחט זכוכית עם נימי סיליקון (B). <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/62006/62006fig04large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62006/62006fig05.jpg"> איור 5. אזור היניקה של דגימת דם (A), דם מוגרר (B) ושלבי איסוף דם (C). <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/62006/62006fig05large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62006/62006fig06.jpg"> איור 6. דגים המופעלים על ידי שאם מראים שפע של ביצים הצביעו על ידי חץ לבן (A) וביצים מופרות (B). <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/62006/62006fig06large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62006/62006fig07.jpg"> איור 7. מראה מורפולוגי (A) ואנטומית (B) של דגים שלמים ועברו כריתת רחם. חצים לבנים (לוחות עליונים) מראים את סימן הניתוח על דג גונקטו. חצים שחורים (לוחות תחתון) מראים קבצים ודגים שלמים. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/62006/62006fig07large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62006/62006fig08.jpg"> איור 8. סימני ניתוח בדגים זכרים ונקביים לאחר 4 שבועות. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/62006/62006fig08large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62006/62006fig09.jpg"> איור 9. רמות הדם של E2 בנקבה (A) ו 11-KT בזכר (B) מדאקה יפנית, 24 שעות לאחר ניתוח מזויף (שליטה), חלקית גונד כריתת או כריתת גונדקטומיה, ו 4 חודשים לאחר כריתת גונדקטומיה (OVX, כריתת השחלות אצל הנקבות; קאס, כריתת סחלבים אצל זכרים). הניתוחים הסטטיסטיים בוצעו באמצעות ANOVA דרך אחת ואחריו מבחן טוקי פוסט הוק. אותיות שונות (a-c) מציגות הבדלים משמעותיים (p-value < 0.05). הנתונים בגרף מסופקים כממוצע + SD, n = 5. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/62006/62006fig09large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td>רמות E2 (נקבות)</td>
			<td>רמות 11-KT (זכרים)</td>
		</tr>
<tr>
<td>המופעל על ידי שיים</td>
			<td>4.15 ± 0.5 (n = 5)</td>
			<td>10.38 ± 1.32 (n = 5)</td>
		</tr>
<tr>
<td>חלקית-gonadectomized</td>
			<td>3.37 ± 0.6 (n = 5)</td>
			<td>8.37 ± 1.92 (n = 5)</td>
		</tr>
<tr>
<td>24h לאחר כריתת גונדקטומיה</td>
			<td>0.36 ± 0.2 (n = 5)</td>
			<td>0.4 ± 0.2 (n = 5)</td>
		</tr>
<tr>
<td>4 חודשים לאחר כריתת גונדקטומיה</td>
			<td>0.54 ± 0.28 (n = 5)</td>
			<td>0.74 ± 0.22 (n = 5)</td>
		</tr>
</tbody></table>טבלה 1. E2 ו 11-KT רמות (ng / mL) אצל נקבות וזכרים של שדים המופעלים במזוף ו gonadectomized וחלקו gonadectomized דגים.

Watch this Scientific Journal Video about Gonadectomy and Blood Sampling Procedures in the Small Size Teleost Model Japanese Medaka Oryzias latipes at JoVE.com

Gonadectomy and Blood Sampling Procedures in the Small Size Teleost Model Japanese Medaka Oryzias latipes

המאמר מתאר פרוטוקול מהיר כדי gonadectomize ולדגום דם מדג הטלוסט הקטן, באמצעות medaka יפני(Oryzias latipes) כמודל, כדי לחקור את התפקיד של סטרואידים מיניים בפיזיולוגיה של בעלי חיים.

הליכי גונדקטומיה ודגימה בדם במודל טלוסט קטן מדאקה(Oryzias latipes)

Sex steroids, produced by the gonads, play an essential role in brain and pituitary tissue plasticity and in the neuroendocrine control of reproduction in ...

gonadectomy-blood-sampling-procedures-small-size-teleost-model

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

Gonadectomy and Blood Sampling Procedures in the Small Size Teleost Model Japanese Medaka (Oryzias latipes)

4.2K Views.  Norwegian University of Life Sciences. המאמר מתאר פרוטוקול מהיר כדי gonadectomize ולדגום דם מדג הטלוסט הקטן, באמצעות medaka יפני(Oryzias latipes) כמודל, כדי לחקור את התפקיד של סטרואידים מיניים בפיזיולוגיה של בעלי חיים. 

Video: Gonadectomy and Blood Sampling Procedures in the Small Size Teleost Model Japanese Medaka Oryzias latipes

Seawater Sampling and Collection

This video documents methods for collecting coastal marine water samples and processing them for various downstream applications including biomass concentration, nucleic acid purification, cell abundance, nutrient and trace gas analyses. For today's demonstration samples were collected from the deck of the HMS John Strickland operating in Saanich Inlet. An A-frame derrick, with a multi-purpose winch and cable system, is used in combination with Niskin or Go-Flo water sampling bottles. Conductivity, Temperature, and Depth (CTD) sensors are also used to sample the underlying water mass. To minimize outgassing, trace gas samples are collected first.  Then, nutrients, water chemistry, and cell counts are determined. Finally, waters are collected for biomass filtration. The set-up and collection time for a single cast is ~1.5 hours at a maximum depth of 215 meters. Therefore, a total of 6 hours is generally needed to complete the collection series described here.

This video documents methods for collecting coastal marine water samples and processing them for various downstream applications including biomass concentration, nucleic acid purification, cell abundance, nutrient and trace gas analyses.

מי ים דגימה אוסף

This video documents methods for collecting coastal marine water samples and processing them for various downstream applications including biomass ...

Noninvasive In Vivo Small Animal MRI and MRS: Basic Experimental Procedures

Small animal Magnetic Resonance (MR) research has emerged as an important element of modern biomedical research due to its non-invasive nature and the richness of biological information it provides. MR does not require any ionizing radiation and can noninvasively provide higher resolution and better signal-to-noise ratio in comparison to other tomographic or spectroscopic modalities. In this protocol, we will focus on small animal MR imaging and MR spectroscopy (MRI/MRS) to noninvasively acquire relaxation weighted 1H images of mouse and to obtain 31P spectra of mouse muscle. This work does not attempt to cover every aspect of small animal MRI/MRS but rather introduces basic procedures of mouse MRI/MRS experiments. The main goal of this work is to inform researchers of the basic procedures for in vivo MR experiments on small animals. The goal is to provide a better understanding of basic experimental procedures to allow researchers new to the MR field to better plan for non-MR components of their studies so that both MR and non-MR procedures are seamlessly integrated.

Noninvasive In Vivo Small Animal MRI and MRS: Basic Experimental Procedures

This work describes basic procedures of noninvasive small animal MRI and MRS in vivo.

פולשנית In vivo קטנים בעלי חיים MRI ו MRS: הפרוצדורות בסיסי

Small animal Magnetic Resonance (MR) research has emerged as an important element of modern biomedical research due to its non-invasive nature and the ...

Microinjection of Medaka Embryos for use as a Model Genetic Organism

In this video, we demonstrate the technique of microinjection into one-cell stage medaka embryos. Medaka is a small egg-laying freshwater fish that allows both genetic and embryological analyses and is one of the vertebrate model organisms in which genome-wide phenotype-driven mutant screens were carried out 1, as in zebrafish and the mouse. Divergence of functional overlap of related genes between medaka and zebrafish allows identification of novel phenotypes that are unidentifiable in a single species 2, thus medaka and zebrafish are complementary for genetic dissection of vertebrate genome functions.
To take advantage of medaka fish whose embryos are transparent and develop externally, microinjection is an essential technique to inject cell-tracers for labeling cells, mRNAs or anti-sense oligonucleotides for over-expressing and knocking-down genes of interest, and DNAs for making transgenic lines.

Medaka and zebrafish are complementary for genetic dissection of vertebrate genome functions. This protocol highlights the key points for successful microinjection into medaka embryos, an important technique for embryological and genetic analysis using medaka and zebrafish in a laboratory.

Microinjection עוברים Medaka לשימוש כמודל אורגניזם גנטי

In this video, we demonstrate the technique of microinjection into one-cell stage medaka embryos. Medaka is a small egg-laying freshwater fish that allows ...

Dechorionation of Medaka Embryos and Cell Transplantation for the Generation of Chimeras

Medaka is a small egg-laying freshwater fish that allows both genetic and embryological analyses and is one of the three vertebrate model organisms in which genome-wide phenotype-driven mutant screens were carried out 1. Divergence of functional overlap of related genes between medaka and zebrafish allows identification of novel phenotypes that are unidentifiable in a single species 2, thus medaka and zebrafish are complementary for genetic dissection of the vertebrate genome functions. Manipulation of medaka embryos, such as dechorionation, mounting embryos for imaging and cell transplantation, are key procedures to work on both medaka and zebrafish in a laboratory. Cell transplantation examines cell autonomy of medaka mutations. Chimeras are generated by transplanting labeled cells from donor embryos into unlabeled recipient embryos. Donor cells can be transplanted to specific areas of the recipient embryos based on the fate maps 3 so that clones from transplanted cells can be integrated in the tissue of interest during development. Due to the hard chorion and soft embryos, manipulation of medaka embryos is more involved than in zebrafish. In this video, we show detailed procedures to manipulate medaka embryos.

Due to the hard chorion and soft embryos, manipulation of medaka embryos is more involved than in zebrafish. This video shows step-by-step procedures for how to manipulate medaka embryos, including dechorionation, mounting in agarose for imaging and cell transplantation for the production of chimeras. These procedures are essential to use medaka and zebrafish in a laboratory to take full advantage of their complementary features for the genetic dissection of vertebrate genome functions.

Dechorionation עוברים Medaka והשתלות Cell עבור דור של מפלצות

Medaka is a small egg-laying freshwater fish that allows both genetic and embryological analyses and is one of the three vertebrate model organisms in ...

Whole-mount Immunohistochemical Analysis for Embryonic Limb Skin Vasculature: a Model System to Study Vascular Branching Morphogenesis in Embryo

Whole-mount immunohistochemical analysis for imaging the entire vasculature is pivotal for understanding the cellular mechanisms of branching morphogenesis. We have developed the limb skin vasculature model to study vascular development in which a pre-existing primitive capillary plexus is reorganized into a hierarchically branched vascular network. Whole-mount confocal microscopy with multiple labelling allows for robust imaging of intact blood vessels as well as their cellular components including endothelial cells, pericytes and smooth muscle cells, using specific fluorescent markers. Advances in this limb skin vasculature model with genetic studies have improved understanding molecular mechanisms of vascular development and patterning. The limb skin vasculature model has been used to study how peripheral nerves provide a spatial template for the differentiation and patterning of arteries. This video article describes a simple and robust protocol to stain intact blood vessels with vascular specific antibodies and fluorescent secondary antibodies, which is applicable for vascularized embryonic organs where we are able to follow the process of vascular development.

We introduce a whole-mount immunohistochemistry and laser scanning confocal microscopy with multiple labelling for analyzing intricate vascular network formation in mouse embryonic limb skin.

Whole-mount עבור ניתוח immunohistochemical vasculature לימב עובריים עור: מערכת מודל לחקר המורפוגנזה מסעף דם בעובר

Whole-mount immunohistochemical analysis for imaging the entire vasculature is pivotal for understanding the cellular mechanisms of branching ...

A Noninvasive Hair Sampling Technique to Obtain High Quality DNA from Elusive Small Mammals

Noninvasive genetic sampling approaches are becoming increasingly important to study wildlife populations. A number of studies have reported using noninvasive sampling techniques to investigate population genetics and demography of wild populations1. This approach has proven to be especially useful when dealing with rare or elusive species2. While a number of these methods have been developed to sample hair, feces and other biological material from carnivores and medium-sized mammals, they have largely remained untested in elusive small mammals. In this video, we present a novel, inexpensive and noninvasive hair snare targeted at an elusive small mammal, the American pika (Ochotona princeps). We describe the general set-up of the hair snare, which consists of strips of packing tape arranged in a web-like fashion and placed along travelling routes in the pikas&#x2019; habitat. We illustrate the efficiency of the snare at collecting a large quantity of hair that can then be collected and brought back to the lab. We then demonstrate the use of the DNA IQ system (Promega) to isolate DNA and showcase the utility of this method to amplify commonly used molecular markers including nuclear microsatellites, amplified fragment length polymorphisms (AFLPs), mitochondrial sequences (800bp) as well as a molecular sexing marker. Overall, we demonstrate the utility of this novel noninvasive hair snare as a sampling technique for wildlife population biologists. We anticipate that this approach will be applicable to a variety of small mammals, opening up areas of investigation within natural populations, while minimizing impact to study organisms.

We present a noninvasive sampling approach to efficiently collect hair samples from elusive small mammals, as shown for the American pika. We demonstrate the utility of this method by extracting DNA from sampled hair and amplifying several types of molecular markers commonly used in studies of wildlife ecology and conservation.

שיער פולשנית דגימה טכניקה לקבל DNA באיכות גבוהה מ יונקים קטנים החמקמק

Noninvasive genetic sampling approaches are becoming increasingly important to study wildlife populations. A number of studies have reported using ...

Quantifying Single Microvessel Permeability in Isolated Blood-perfused Rat Lung Preparation

The isolated blood-perfused lung preparation is widely used to visualize and define signaling in single microvessels. By coupling this preparation with real time imaging, it becomes feasible to determine permeability changes in individual pulmonary microvessels. Herein we describe steps to isolate rat lungs and perfuse them with autologous blood. Then, we outline steps to infuse fluorophores or agents via a microcatheter into a small lung region. Using these procedures described, we determined permeability increases in rat lung microvessels in response to infusions of bacterial lipopolysaccharide. The data revealed that lipopolysaccharide increased fluid leak across both venular and capillary microvessel segments. Thus, this method makes it possible to compare permeability responses among vascular segments and thus, define any heterogeneity in the response. While commonly used methods to define lung permeability require postprocessing of lung tissue samples, the use of real time imaging obviates this requirement as evident from the present method. Thus, the isolated lung preparation combined with real time imaging offers several advantages over traditional methods to determine lung microvascular permeability, yet is a straightforward method to develop and implement.

The isolated blood-perfused lung preparation makes it feasible to visualize microvessel networks on the lung surface. Here we describe an approach to quantify permeability of single microvessels in isolated lungs using real time fluorescence imaging.

כימות יחיד כלי דם קטנים בחדירות מבודדת-perfused דם עכברוש ריאות הכנה

The isolated blood-perfused lung preparation is widely used to visualize and define signaling in single microvessels. By coupling this preparation with ...

Non-Terminal Blood Sampling Techniques in Guinea Pigs

Guinea pigs possess several biological similarities to humans and are validated experimental animal models1-3. However, the use of guinea pigs currently represents a relatively narrow area of research and descriptive data on specific methodology is correspondingly scarce. The anatomical features of guinea pigs are slightly different from other rodent models, hence modulation of sampling techniques to accommodate for species-specific differences, e.g., compared to mice and rats, are necessary to obtain sufficient and high quality samples. As both long and short term in vivo studies often require repeated blood sampling the choice of technique should be well considered in order to reduce stress and discomfort in the animals but also to ensure survival as well as compliance with requirements of sample size and accessibility. Venous blood samples can be obtained at a number of sites in guinea pigs e.g., the saphenous and jugular veins, each technique containing both advantages and disadvantages4,5. Here, we present four different blood sampling techniques for either conscious or anaesthetized guinea pigs. The procedures are all non-terminal procedures provided that sample volumes and number of samples do not exceed guidelines for blood collection in laboratory animals6. All the described methods have been thoroughly tested and applied for repeated in vivo blood sampling in studies within our research facility.

Though a known model, the guinea pig currently represents a niche in experimental animal sciences and limited data is available on the execution of most procedures. Here we present four different approaches to non-terminal in vivo blood sampling techniques in either conscious or anaesthetized guinea pigs.

טכניקות דגימת דם ללא מסוף בגינאה חזירים

Guinea pigs possess several biological similarities to humans and are validated experimental animal models1-3. However, the use of guinea pigs currently ...

Sampling Blood from the Lateral Tail Vein of the Rat

Blood samples are commonly obtained in many experimental contexts to measure targets of interest, including hormones, immune factors, growth factors, proteins, and glucose, yet the composition of the blood is dynamically regulated and easily perturbed. One factor that can change the blood composition is the stress response triggered by the sampling procedure, which can contribute to variability in the measures of interest. Here we describe a procedure for blood sampling from the lateral tail vein in the rat. This procedure offers significant advantages over other more commonly used techniques. It permits rapid sampling with minimal pain or invasiveness, without anesthesia or analgesia. Additionally, it can be used to obtain large volume samples (upwards of 1 ml in some rats), and it may be used repeatedly across experimental days. By minimizing the stress response and pain resulting from blood sampling, measures can more accurately reflect the true basal state of the animal, with minimal influence from the sampling procedure itself.

Blood samples are useful for assessing biomarkers of physiological states or disease in vivo. Here we describe the methodology to sample blood from the lateral tail vein in the rat. This method provides rapid samples with minimal pain and invasiveness.

דגימת דם מוריד הזנב לרוחב של העכברוש

Blood samples are commonly obtained in many experimental contexts to measure targets of interest, including hormones, immune factors, growth factors, ...

Noninvasive Monitoring of Lesion Size in a Heterologous Mouse Model of Endometriosis

Here, we describe a protocol for the implementation of a heterologous mouse model in which progression of endometriosis can be assessed in real time through noninvasive monitoring of fluorescence emitted by implanted ectopic human endometrial tissue. For this purpose, biopsies of human endometrium are obtained from donor women ongoing oocyte donation. Human endometrial fragments are cultured in the presence of adenoviruses engineered to express cDNA for the reporter fluorescent protein mCherry. Upon visualization, labeled tissues with an optimal rate of fluorescence after infection are subsequently chosen for the implantation in recipient mice. One week prior to the implantation surgery, recipient mice are oophorectomized, and estradiol pellets are placed subcutaneously to sustain the survival and growth of lesions. On the day of surgery mice are anesthetized, and peritoneal cavity accessed through a small (1.5 cm) incision by the linea-alba. Fluorescently labeled implants are tweezed, briefly soaked in glue and attached to the peritoneal layer. Incisions are sutured, and animals left to recover for a couple of days. Fluorescence emitted by endometriotic implants is usually non-invasively monitored every 3 days for 4 weeks with an in vivo imaging system. Variations in the size of endometriotic implants can be estimated in real time by quantification of the mCherry signal and normalization against the initial time-point showing maximal fluorescence intensity.
Traditional preclinical rodents of models of endometriosis do not allow non-invasive monitoring of lesion in real time but rather allow evaluation of the effects of drugs assayed at the end point. This protocol allows one to track lesions in real time and is more useful to explore the therapeutic potential of drugs in preclinical models of endometriosis. The main limitation of the model thus generated is that non-invasive monitoring is not possible over long periods of time due to the episomal expression of Ad-virus.

Here, we present a protocol for live-imaging of fluorescently labeled human endometrial fragments grafted in mice. The method allows studying the effects of drugs of choice on endometriotic lesion size through monitoring and quantification of fluorescence emitted by the fluorescent reporter on real time

ניטור לא פולשנית של גודל הנגע במודל של עכברים Heterologous ' של אנדומטריוזיס

Here, we describe a protocol for the implementation of a heterologous mouse model in which progression of endometriosis can be assessed in real time ...