אנו מודים לתורמים ומשתמשים רבים ל-CT-FIRE ו-CurveAlign לאורך השנים, כולל ד"ר רוב נובאק, ד"ר קרולין פלקה, ד"ר ג'רמי ברדפלדט, גונת מהטה, אנדרו ליכט, ד"ר אדיב קיחוסרבי, ד"ר מאט קונקלין, ד"ר ג'יין סקווירל, ד"ר פאולו פרובנזנו, ד"ר ברנדה אוגל, ד"ר פטרישיה קילי, ד"ר ג'וזף סולצ'בסקי, ד"ר סוזן פוניק ותרומות טכניות נוספות מסוואטי אנאנד וקרדיט. עבודה זו נתמכה על ידי מימון של חברת מחקר מוליכים למחצה, מכון מורגרידג' למחקר, ו NIH מענקים R01CA199996, R01CA181385 ו U54CA210190 כדי K.W.E.

למחברים אין מה לחשוף.

פרוטוקול זה מתאר את השימוש CT-FIRE ו CurveAlign עבור כימות קולגן fibrillar והוא יכול להיות מיושם על כל תמונה עם סיבי קולגן או מבנים מוארכים אחרים דמויי קו או סיבים מתאים לניתוח על ידי CT-FIRE או CurveAlign. לדוגמה, אלסטין או סיבים אלסטיים יכולים להיות מעובדים באופן דומה בפלטפורמה זו. בדקנו את שני הכלים על סיבים סינתטיים שנוצרו באופן חישובי21. בהתאם ליישום, על המשתמשים לבחור את מצב הניתוח המתאים ביותר לנתונים שלהם. מצב ניתוח סיבי CT יכול להשתמש ישירות עקומות ב- CT כדי לייצג מיקום סיבים וכיוון, והוא רגיש לשינויים במבנה הסיבים המקומי. ניתן להשתמש במצב CT לאיתור סיבים והתמצאותם בתנאים מורכבים, למשל, כאשר רמת הרעש גבוהה, הסיבים מפותלים, או שהשינוי בעובי הסיבים גבוה. עם זאת, כמו מצב CT רק מרים את החלקים הבהירים ביותר של תמונה, זה יחמיץ כמה סיבים בעוצמה נמוכה יותר כאשר יש וריאציה גדולה בעוצמת התמונה.
יתר על כן, מצב CT אינו מספק מידע על סיבים בודדים. בניגוד למצב CT- , מצב CT-FIRE מחשב תכונות סיבים בודדים ויכול לנתח את כל הסיבים שעוצמתם נמצאת מעל סף שצוין. האתגרים הקשורים למצב CT-FIRE כוללים: 1) הדיוק של מיצוי סיבים שלמים עשוי להיות מופחת או בסכנה כאשר יש וריאציה גדולה בעוצמה לאורך סיבים או עובי הסיבים על פני תמונה; ו-2) הניתוח הסטנדרטי הנוכחי תובעני מבחינה חישובית כאמור בפרוטוקול. פרטים נוספים על היתרונות והמגבלות של שיטות אלה ניתן לראות בפרסומים הקודמים שלנו20,21.
בכל הנוגע לדיוק המעקב אחר סיבים, המשתמש יכול להסתמך בעיקר על בדיקה ויזואלית כדי לבדוק את התמונה החופפת שבה הסיבים שחולצו או האוריינטציות הייצוגיות מכוסים בתמונה המקורית. בנוסף, עבור CT-FIRE, המשתמש יכול להשתמש במודול שלאחר העיבוד המתקדם כדי לזהות את המאפיינים של סיבים בודדים נבחרים, ולהשוות אותם למדידות באמצעות כלי ניתוח תמונה אחרים כגון פיג'י46. עבור CurveAlign, המשתמש יכול להשוות את תוצאות הכיוון או היישור לאלה שחושבו על ידי כלים אחרים כגון OrientationJ16 ו- CytoSpectre17.
בין התכונות הזמינות לפלט על ידי הפלטפורמה, תכונות הקשורות ליישור נמצאות בשימוש תכוף ביותר והן האמינות והחזקות ביותר. כדי להשתמש בתכונות סיבים בודדות, המשתמש צריך לאשר את החילוץ של תכונות סיבים מייצגות. יש לציין כי סיב שלם עשוי להיות מחולק למספר מקטעים קצרים יותר בנסיבות מסוימות, אשר המשתמש צריך לקחת בחשבון בעת בחירת מצב ניתוח סיבים או ביצוע ניתוח סטטיסטי נוסף. גם כאשר לא ניתן להשתמש ישירות באורך הסיבים כמאפיין דומה, הכיוון או הרוחב של מקטעי סיבים המשוקללים כנגד אורכם עשויים עדיין להצביע על מידע שימושי. בכל הנוגע להדמיית SHG, צמצם מספרי (NA) של העדשה האובייקטיבית יכול להשפיע באופן משמעותי על זיהוי הרוחב והאורך של סיב, אך יש לו פחות השפעה על מדידות הכיוון והיישור. מניסיוננו בהדמיית SHG, אנחנו בדרך כלל צריכים להשתמש בעדשה אובייקטיבית עם הגדלה של פי 40 ומעלה עם NA ≥ 1.0 כדי להשיג מדידת עובי סיבים חזקה.
"יישור" יכול להתפרש בשלוש דרכים שונות: 1) יישור ביחס לכיוון האופקי החיובי בשם "זווית", החל 0 עד 180 מעלות, שבו זוויות קרוב ל 0 יש כיוון דומה זוויות קרוב ל 180 מעלות; 2) יישור ביחס לגבול בשם "זווית יחסית", הנע בין 0 ל 90 מעלות, עם 0 מעלות המציין סיב מקביל לגבול ו 90 המציין סיבים בניצב; ו-3) יישור סיבים ביחס זה לזה בשם "מקדם יישור", הנע בין 0 ל-1, כאשר 1 מציין סיבים מיושרים בצורה מושלמת וערכים קטנים יותר המייצגים סיבים המפוזרים באופן אקראי יותר.
מלבד תכונות הסיבים המחושבות בפלטפורמה זו, הוצעו גם כמה מדדים המבוססים על ניתוח מרקם47,48,49 לכמת דפוסי ECM. תכונות אלה הקשורות למרקם יכולות לספק מתאר חלופי או נוסף של ECM ביישומים מסוימים. האתגרים להתפתחות מדדים מסוג זה טמונים בשילוב של הרלוונטיות הביולוגית האפשרית, האפיון המקומי והדיוק של איתור סיבים בודדים.
כדי למטב את הפרמטרים הפועלים ולבצע פתרון בעיות, המשתמש יכול להתייחס לפרסומים הידניים הרלוונטיים20,21 וכן לסרגלים הצדדיים של השאלות הנפוצות בדפי הוויקי של GitHub של מאגר העקומות: https://github.com/uw-loci/curvelets/wiki. עבור לחצנים מסוימים, רמז לפונקציה עשוי להיראות כמנחה את המשתמש לפעולה הנוכחית או הבאה כאשר המשתמש מזיז את סמל העכבר מעל לחצן. עקוב אחר המידע בחלון ה- GUI או בחלון הפקודה כדי לבצע את פתרון הבעיות.
לעיבוד ערכת נתונים גדולה, מומלץ למשתמש להשתמש באפשרויות מחשוב מקביליות, המאפשרות לכלי לעבד תמונות מרובות בו-זמנית. אפשרות אחת היא שימוש בליבות CPU מרובות אם הן זמינות במחשב המנוצל. לחלופין, גרסה חסרת ראש של שני APPs מסופקת והורכבה בהצלחה בצומת ההידור דרך השרת שנערך במרכז50 מבוסס קונדור למחשוב תפוקה גבוהה (CHTC) באוניברסיטת ויסקונסין-מדיסון. זרימת העבודה CHTC עבור כימות סיבים בקנה מידה גדול פותחה, נבדקה, והשתמשו בהצלחה על ערכות תמונה אמיתיות המורכבות מאלפי תמונות. המשתמש יכול להתאים את הפונקציות MATLAB חסרות הראש של CT-FIRE ו CurveAlign להפעלת כימות על מערכות מחשוב ענן אחרות כולל שירותים מסחריים כגון אלה המוצעים על ידי אמזון, גוגל, ומיקרוסופט.
כיווני הפיתוח המתמשכים והעתידיים כוללים: 1) שילוב של רשת עצבית למידה עמוקה כדי לחלץ או ליצור תמונות סיבי קולגן סינתטיים באיכות גבוהה ולשפר את החוסן והדיוק של אלגוריתם מעקב סיבים; 2) שילוב כל המודולים בפלטפורמה מקיפה תוך אופטימיזציה של הקוד והתיעוד בהתאם לשיטות העבודה המומלצות להנדסת תוכנה; 3) פריסה של כל תכונות הליבה בפלטפורמת מחשוב ענן; 4) שיפור זרימת העבודה של ניתוח סיבים באמצעות שירות CHTC; ו -5) שיפור הפונקציונליות של מחולל הסיבים הסינתטיים.

קולגני פיברילאר בולטים, מרכיבי ECM מבניים. הארגון שלהם משנה את תפקוד רקמת ההשפעה והם קשורים ככל הנראה עם התקדמות של מחלות רבות החל osteogenesis imperfecta1, תפקוד לקוי של הלב2, ואת הפצע ריפוי3 סוגים שונים של סרטן כולל השד4,5,6, השחלות7,8, כליות9, וסרטן הלבלב10. ניתן להשתמש באופני הדמיה מבוססים רבים כדי לדמיין קולגן פיברילאר כגון מיקרוסקופיה דור הרמוני שני11, כתמים או צבעים בשילוב עם מיקרוסקופיה שדה בהיר או פלואורסצנטי או מיקרוסקופ אור מקוטב12, מיקרוסקופ קיטוב מבוסס גביש נוזלי (LC-PolScope)13, ומיקרוסקופ אלקטרונים14. ככל שהחשיבות של ארגון קולגן פיברילאר הפכה ברורה יותר, והשימוש בשיטות אלה גדל, גדל גם הצורך בגישות משופרות לניתוח סיבי קולגן.
היו מאמצים רבים לפתח שיטות חישוביות למדידה אוטומטית של קולגן פיברילאר. כלי תוכנה זמינים בחופשיות מתמקדים בעיקר בחישוב יישור סיבים או אוריינטציה על ידי אימוץ טנזור נגזר או מבנה ראשון עבור פיקסלים15,16, או ניתוח ספקטרום מבוסס שינוי פורייה עבור אריחי תמונה17. כל הכלים הללו כפופים למגבלות כגון דרישה לשלבים ידניים, אי דיוק בזיהוי קצה הסיבים ברקע רועש או היעדר אפיון תכונות מקומי.
בהשוואה לכלי תוכנה חופשיים אחרים הזמינים באופן חופשי בקוד פתוח, השיטות המתוארות בפרוטוקול זה משתמשות ב- CT - שיטת ייצוג תמונה אופטימלית, רב-גוונית וכיוונית - כדי להסיר רעש מתמונות קולגן פיברילאר ולשפר או לעקוב אחר קצוות סיבים. ניתן לספק מידע על מיקום והתמצאות ישירות מסיבים ולא באמצעות המידע העקיף מבחינת פיקסלים או מבחינת חלונות כדי להסיק את המדדים של ארגון הסיבים. מסגרת מבוססת CT זו18,19,20,21 יכולה לכמת את ארגון הסיבים על בסיס גלובלי, החזר על ההשקעה או סיבים, בעיקר באמצעות שתי חבילות נפרדות, אך מקושרות, בשם "CT-FIRE"18,21 ו- "CurveAlign"19,21. בכל הנוגע ליישום התוכנה, ב- CT-FIRE, מקדמי CT על קשקשים מרובים יכולים לשמש לשחזור תמונה המשפרת קצוות ומפחיתה רעש. לאחר מכן, אלגוריתם מיצוי סיבים בודד מוחל על התמונה המשוחזרת על ידי CT כדי לעקוב אחר סיבים למציאת נקודות המרכז הייצוגיות שלהם, הרחבת ענפי סיבים מנקודות המרכז וקישור ענפי סיבים ליצירת רשת סיבים. ב- CurveAlign, מקדמי CT בקנה מידה שצוין על-ידי המשתמש יכולים לשמש למעקב אחר כיוון סיבים מקומי, שבו הכיוון והמיקומים של עקומות מופקים ומקובצים כדי להעריך את כיוון הסיבים במיקומים המתאימים. מסגרת כימות זו פותחה במשך יותר מעשר שנים והתפתחה מאוד בהיבטים רבים כגון פונקציונליות, ממשק משתמש ומודולריות. לדוגמה, כלי זה יכול לדמיין כיוון סיבים מקומי ומאפשר למשתמש למדוד עד שלושים תכונות סיבים כולל תכונות סיבים בודדים כגון אורך, זווית, רוחב וישירות, כמו גם מדידות בצובר כגון צפיפות ויישור. בנוסף, המשתמש יכול למדוד זווית סיבים יחסית באופן ידני או אוטומטי גבולות מקוטעים, אשר, למשל, ממלא תפקיד חשוב בהתפתחות סמן ביולוגי מבוסס תמונה בסרטן השד22 ומחקרי סרטן הלבלב10. פלטפורמה זו מספקת מספר מודולי תכונות, כולל מודולים לניתוח החזר על ההשקעה, יצירת גבולות אוטומטית ולאחר עיבוד. ניתן להשתמש במודול ההחזר על ההשקעה כדי להוסיף ביאורים לצורות שונות של החזר ההשקעה ולבצע ניתוח החזר על ההשקעה המתאים. כדוגמה ליישום, מודול יצירת הגבולות האוטומטי יכול לשמש לרישום תמונות שדה בהירות של המטוקסילין ואאוסין (H&E) עם תמונות דור הרמוני שני (SHG) וליצור את מסכת התמונה של גבולות הגידול מתמונות H&E הרשומות. מודול שלאחר העיבוד יכול לסייע בעיבוד ואינטגרציה של קבצי נתוני פלט מתמונות בודדות לצורך ניתוח סטטיסטי אפשרי.
פלטפורמת כימות זו אינה דורשת ניסיון קודם בתכנות או בעיבוד תמונה ויכולה לטפל בערכות נתונים גדולות הכוללות מאות או אלפי תמונות, המאפשרות כימות יעיל של ארגון קולגן עבור יישומים ביולוגיים או ביו-רפואיים. זה כבר בשימוש נרחב בתחומי מחקר שונים על ידי חוקרים רבים בכל רחבי העולם, כולל את עצמנו. ישנם ארבעה פרסומים עיקריים על CT-FIRE ו CurveAlign18,19,20,21, מתוכם שלושת הראשונים צוטטו 272 פעמים (נכון ל 2020-05-04 על פי Google Scholar). סקירה של הפרסומים שציטטו פלטפורמה זו (CT-FIRE או CurveAlign) מצביעה על כך שיש כ -110 כתבי עת שהשתמשו בו ישירות לניתוח שלהם, שבו כ -35 פרסומים היו בשיתוף פעולה עם הקבוצה שלנו, והאחרים (~ 75) נכתבו על ידי קבוצות אחרות. למשל, פלטפורמה זו שימשה למחקרים הבאים: סרטן השד22,23,24, סרטןהלבלב 10,25, סרטן הכליה9,26, ריפוי פצעים3,27,28,29,30, סרטן השחלות8,31,7, רצועה הרחם32, hypophosphatemic dentin33, קרצינומה של תאי בזלת34, סרקומה היפוקסית35, רקמת סחוס36, תפקוד לקוי של הלב37, נוירונים38, גליובלסטומה39, התכווצויות לימפתיות40, cacffolds סיבי41, סרטןקיבה 42, microtubule43, ופיברוזיס שלפוחית השתן44. איור 1 מדגים את יישום ההדמיה של סרטן CurveAlign כדי למצוא את חתימות הקולגן הקשורות לגידול של סרטן השד19 מתמונת SHG. איור 2 מתאר זרימת עבודה סכמטית טיפוסית של פלטפורמה זו. למרות שכלים אלה נבדקו טכנית18,19,21, ופרוטוקול רגיל20 לניתוח יישור עם CurveAlign זמין גם, פרוטוקול חזותי המדגים את כל התכונות החיוניות יכול להיות שימושי. פרוטוקול חזותי, כפי שמוצג כאן, יקל על תהליך הלמידה של שימוש בפלטפורמה זו, כמו גם יתייחס בצורה יעילה יותר לחששות ולשאלות שעשויות להיות למשתמשים.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>CT-FIRE</td>
			<td>Univerity of Wisconsin-Madison</td>
			<td>N/A</td>
			<td>open source software available from https://eliceirilab.org/software/ctfire/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CurveAlign</td>
			<td>University of Wisconsin-Madison</td>
			<td>N/A</td>
			<td>open source software available from https://eliceirilab.org/software/curvealign/</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantifying fibrillar collagen organization with curvelet transform-based tools

קולגנים Fibrillar הם מרכיבים בולטים מטריצה חוץ תאית (ECM), ושינויים בטופולוגיה שלהם הוכחו להיות קשורים עם התקדמות של מגוון רחב של מחלות כולל השד, השחלות, הכליות, סרטן הלבלב. כלי תוכנה לכימות סיבים הזמינים באופן חופשי מתמקדים בעיקר בחישוב יישור סיבים או אוריינטציה, והם כפופים למגבלות כגון דרישה של צעדים ידניים, אי דיוק בזיהוי קצה הסיבים ברקע רועש, או חוסר אפיון תכונות מקומי. הכלי לכמות סיבי קולגן המתואר בפרוטוקול זה מאופיין בשימוש בייצוג תמונה רב-גווני אופטימלי המופעל על-ידי המרה מעוגלת (CT). גישה אלגוריתמית זו מאפשרת הסרת רעש מתמונות קולגן פיברילאר ושיפור קצוות הסיבים כדי לספק מידע מיקום והתמצאות ישירות מסיבים, במקום להשתמש במידע העקיף מבחינת פיקסלים או מבחינת חלונות המתקבל מכלים אחרים. מסגרת מבוססת CT זו מכילה שתי חבילות נפרדות, אך מקושרות, בשם "CT-FIRE" ו- "CurveAlign" שיכולות לכמת את ארגון הסיבים על בסיס גלובלי, אזור עניין (ROI) או סיבים בודדים. מסגרת כימות זו פותחה במשך יותר מעשר שנים וכעת התפתחה לפלטפורמת כימות קולגן מקיפה ומונעת על ידי משתמשים. באמצעות פלטפורמה זו, ניתן למדוד עד כשלושים תכונות סיבים כולל תכונות סיבים בודדים כגון אורך, זווית, רוחב וישירות, כמו גם מדידות בצובר כגון צפיפות ויישור. בנוסף, המשתמש יכול למדוד זווית סיבים יחסית לגבולות מחולקים באופן ידני או אוטומטי. פלטפורמה זו מספקת גם מספר מודולים נוספים, כולל מודולים לניתוח החזר על ההשקעה, יצירת גבולות אוטומטית ולאחר עיבוד. שימוש בפלטפורמה זו אינו דורש ניסיון קודם בתכנות או בעיבוד תמונה, והוא יכול להתמודד עם ערכות נתונים גדולות כולל מאות או אלפי תמונות, המאפשר כימות יעיל של ארגון סיבי קולגן עבור יישומים ביולוגיים או ביו-רפואיים.

שיטות אלה יושמו בהצלחה במחקרים רבים. כמה יישומים אופייניים כוללים: 1) Conklin et al.22 השתמשו CurveAlign כדי לחשב חתימות קולגן הקשורות לגידול, ומצא כי סיבי קולגן היו מיושרים לעתים קרובות יותר בניצב להיקף צינור קרצינומה צינורית במקום (DCIS) נגעים; 2) Drifka et al.10 השתמשו במצב CT-FIRE ב CurveAlign כדי לכמת את יישור קולגן stromal עבור אדנוקרצינומה צינורית הלבלב ורקמות דלקת לבלב נורמלית / כרונית, ומצא כי היה יישור מוגבר ברקמות סרטן לעומת זה ברקמות נורמליות / כרוניות; 3) Alkmin et al.7 השתמשו CurveAlign לכמת את ההתפלגות הזוויתית של סיבי F-actin ויישור קולגן הכולל מן התמונות SHG של קולגן סטרומה השחלות, והראה כי מורפולוגיה מטריצה ממלא תפקיד חשוב בהנעת תנועתיות התא יישור F-actin; 4) LeBert et al.3 להחיל CT-FIRE על תמונות SHG של מודל תיקון פצע זברה ומצא עלייה בעובי של סיבי קולגן לאחר פציעה חריפה; 5) Devine et al.45 השתמשו במצב CT-FIRE ב CurveAlign עבור תמונות SHG של קולגן קיפול קולי מדגמים שונים של בעלי חיים כדי למדוד תכונות סיבים בודדים יישור כללי, והראה כי קולגן קיפול ווקאלי חזירי וכלבים היה יישור גבוה יותר ישר נחות; 6) Keikhosravi et al.13 השתמשו CurveAlign לכמת יישור קולגן בדגימות היסטופתולוגיה בתמונה עם LC-PolScope, והראה כי LC-PolScope ו SHG דומים במונחים של יישור מדידת אוריינטציה עבור סוגים מסוימים של רקמה.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61931/61931fig01.jpg"> איור 1: שימוש ב- CurveAlign כדי למצוא חתימות קולגן הקשורות לגידול מתמונות SHG של מיקרו-סדרה של רקמת סרטן השד האנושי (TMA). (A) תמונת שכבת-על של ליבת TMA עם תמונת SHG (צהובה) מכוסה בתמונת השדה הבהיר H&E המתאימה. (B)אזור העניין של(A). (C) תמונת השדה הבהיר של (B). (D)תמונת SHG של (B). (F) המסיכה המשויכת לתמונת השדה הבהיר (C). (ה)תמונת שכבת-העל של הפלט CurveAlign המציגה את גבולות הגידול (צהוב) מ- (F), מיקומי סיבים מייצגים וכיוון (קווים ירוקים); הקווים הכחולים משמשים לשייך סיבים לגבולות הקרובים ביותר שלהם. החצים הירוקים ב- (B) ו - (E) מציגים את הסיבים המקבילים לגבול הגידול, בעוד החצים האדומים שם מראים את הסיבים בניצב לגבול. סרגל קנה המידה ב-( A) שווה ל- 200 מיקרומטר. התמונות ב-( B)–(F) מוצגות באותו קנה מידה, וסרגל קנה המידה הייצוגי ב-( D) שווה ל- 50 מיקרומטר. קיצורים: SHG = דור הרמוני שני; H&E = המטוקסילין ואאוסין. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/61931/61931fig01large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61931/61931fig02.jpg"> איור 2: זרימת עבודה סכמטית של כימות של תמונת קולגן פיברילאר. (A) תמונת SHG שתנותח על-ידי CT-FIRE ו/או עקומהאליון. (B)שכבת-על של פלט תמונה על-ידי CT-FIRE. גבול מסיכה(A)הוא קלט אופציונלי של יישור עקומה. (D) פלט תמונת שכבת-על לפי יישור עקומה. קווי הצבע ב- (B) מייצגים את הסיבים שחולצו. ב- (D), הקווים הירוקים מציינים את מיקומם וכיווני הסיבים הנמצאים מחוץ לגבולות (קווים צהובים) והם נמצאים במרחק שצוין מגבולותיהם הקרובים ביותר, הקווים האדומים הם אלה של סיבים אחרים, והקווים הכחולים משמשים לשייך סיבים לגבולות הקרובים ביותר שלהם. תמונות ב-( A)–(D) מוצגות באותו קנה מידה, וסרגל קנה המידה הייצוגי ב- (A)שווה ל- 200מיקרומטר. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/61931/61931fig02large.jpg" target="_blank"></a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61931/61931fig03.jpg"> איור 3: ניתוח רגיל CT-FIRE. (A)ממשק משתמש גרפי ראשי. (B) טבלת פלט המציגה את סטטיסטיקת הסיכום. (C) ו- (F) מציגים את ההיסטוגרמות של זווית ורוחב, בהתאמה. (E) תמונת פלט המציגה את הסיבים שחולצו (קווי צבע) מכוסים בתמונת SHG המקורית (D). קיצורים: GUI = CT = המרה מעוגלת; ממשק משתמש גרפי; SHG = דור הרמוני שני. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/61931/61931fig03large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61931/61931fig04.jpg"> איור 4: מודול ניהול החזר על ההשקעה של CT-FIRE. (A) ממשק משתמש גרפי של מודול. (B) החזר על ההשקעה לאחר ניתוח של ארבעה ROIs עם צורות שונות המציגות את הסיבים בתוך כל החזר על ההשקעה. (C) היסטוגרמות ROI של תכונות סיבים שונים. קיצורים: CT = המרה מעוגלת; ממשק משתמש גרפי = ממשק משתמש גרפי; החזר על ההשקעה = אזור עניין. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/61931/61931fig04large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61931/61931fig05.jpg"> איור 5: מודול מתקדם לאחר עיבוד CT-FIRE. (A) ממשק משתמש גרפי של מודול. (B)מדידות של שלושה סיבים נבחרים. (C) תצוגה חזותית של שלושת הסיבים שנבחרו ב- (B). (D) סטטיסטיקת סיכום לאחר החלת סף אורך (>60 פיקסלים). (E) תצוגה חזותית של הסיבים שנבחרו ב- (D) עם סרגל צבעים מבוסס אורך. קיצורים: CT = המרה מעוגלת; ממשק משתמש גרפי = ממשק משתמש גרפי. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/61931/61931fig05large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61931/61931fig06.jpg"> איור 6: ניתוח רגיל של יישור עקומה. (A)ממשק משתמש גרפי ראשי. (B) טבלת פלט המציגה את סטטיסטיקת הסיכום. (C) תמונת פלט המציגה את המיקומים והכיוון של סיבים מייצגים (קווים ירוקים) וגבולות (קווים צהובים) מכוסים בתמונת SHG המקורית, הקווים הכחולים משמשים לשייך סיבים לגבולות הקרובים ביותר שלהם, קווים אדומים מציגים את המיקומים וההתמצאות של סיבים בתוך גבול או מחוץ לגבול (>מרחק שצוין על ידי המשתמש, למשל, 250 פיקסלים כאן). (D) מפת חום של הזוויות: אדום (> 60 מעלות), צהוב (45-60] מעלות, ירוק (10, 45] מעלות. (E)–(F) מציג את התפלגות הזווית באמצעות היסטוגרמה ועלילה מצפן, בהתאמה. קיצורים: ממשק משתמש גרפי = ממשק משתמש גרפי; SHG = דור הרמוני שני. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/61931/61931fig06large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61931/61931fig07.jpg"> איור 7: מודול ניהול החזר החזר על ההשקעה בעקומה. (A)ממשק המשתמש הגרפי של המודול. (B)ארבעה ROIs מלבניים מבוארים מכוסים בתמונה המקורית. (C) טבלת פלט לאחר ניתוח החזר על ההשקעה. (D)היסטוגרמה זוויתית של כל החזר על ההשקעה. קיצורים: החזר על ההשקעה = אזור עניין; ממשק משתמש גרפי = ממשק משתמש גרפי. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/61931/61931fig07large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Quantifying Fibrillar Collagen Organization with Curvelet Transform-Based Tools at JoVE.com

Quantifying Fibrillar Collagen Organization with Curvelet Transform-Based Tools

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לשימוש מבוסס טרנספורמציה מעוקל, קוד פתוח MATLAB תוכנה כלי לכימות ארגון קולגן fibrillar במטריצה חוץ תאית של רקמות נורמליות ומחלות כאחד. ניתן להחיל כלי זה על תמונות עם סיבי קולגן או סוגים אחרים של מבנים דמויי קו.

כימות ארגון קולגן פיברילאר עם כלים מבוססי המרה של Curvelet

Fibrillar collagens are prominent extracellular matrix (ECM) components, and their topology changes have been shown to be associated with the progression ...

quantifying-fibrillar-collagen-organization-with-curvelet-transform

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Bioengineering

5.9K Views.  University of Wisconsin-Madison. כאן, אנו מציגים פרוטוקול לשימוש מבוסס טרנספורמציה מעוקל, קוד פתוח MATLAB תוכנה כלי לכימות ארגון קולגן fibrillar במטריצה חוץ תאית של רקמות נורמליות ומחלות כאחד. ניתן להחיל כלי זה על תמונות עם סיבי קולגן או סוגים אחרים של מבנים דמויי קו.

Video: Quantifying Fibrillar Collagen Organization with Curvelet Transform-Based Tools

Preparation of Complaint Matrices for Quantifying Cellular Contraction

The regulation of cellular adhesion to the extracellular matrix (ECM) is essential for cell migration and ECM remodeling. Focal adhesions are macromolecular assemblies that couple the contractile F-actin cytoskeleton to the ECM. This connection allows for the transmission of intracellular mechanical forces across the cell membrane to the underlying substrate. Recent work has shown the mechanical properties of the ECM regulate focal adhesion and F-actin morphology as well as numerous physiological processes, including cell differentiation, division, proliferation and migration. Thus, the use of cell culture substrates has become an increasingly prevalent method to precisely control and modulate ECM mechanical properties.
To quantify traction forces at focal adhesions in an adherent cell, compliant substrates are used in conjunction with high-resolution imaging and computational techniques in a method termed traction force microscopy (TFM). This technique relies on measurements of the local magnitude and direction of substrate deformations induced by cellular contraction. In combination with high-resolution fluorescence microscopy of fluorescently tagged proteins, it is possible to correlate cytoskeletal organization and remodeling with traction forces.
Here we present a detailed experimental protocol for the preparation of two-dimensional, compliant matrices for the purpose of creating a cell culture substrate with a well-characterized, tunable mechanical stiffness, which is suitable for measuring cellular contraction. These protocols include the fabrication of polyacrylamide hydrogels, coating of ECM proteins on such gels, plating cells on gels, and high-resolution confocal microscopy using a perfusion chamber. Additionally, we provide a representative sample of data demonstrating location and magnitude of cellular forces using cited TFM protocols.

In this video, we demonstrate the experimental techniques used to fabricate compliant, extracellular matrix (ECM) coated substrates suitable for cell culture, and which are amenable to traction force microscopy and observing effects of ECM stiffness on cell behavior.

הכנת מטריצות תלונה לכימות התכווצות נייד

The regulation of cellular adhesion to the extracellular matrix (ECM) is essential for cell migration and ECM remodeling.  Focal adhesions are ...

Quantifying the Mechanical Properties of the Endothelial Glycocalyx with Atomic Force Microscopy

Our understanding of the interaction of leukocytes and the vessel wall during leukocyte capture is limited by an incomplete understanding of the mechanical properties of the endothelial surface layer. It is known that adhesion molecules on leukocytes are distributed non-uniformly relative to surface topography 3, that topography limits adhesive bond formation with other surfaces 9, and that physiological contact forces (&asymp; 5.0 &minus; 10.0 pN per microvillus) can compress the microvilli to as little as a third of their resting length, increasing the accessibility of molecules to the opposing surface 3, 7. We consider the endothelium as a two-layered structure, the relatively rigid cell body, plus the glycocalyx, a soft protective sugar coating on the luminal surface 6. It has been shown that the glycocalyx can act as a barrier to reduce adhesion of leukocytes to the endothelial surface 4. In this report we begin to address the deformability of endothelial surfaces to understand how the endothelial mechanical stiffness might affect bond formation. Endothelial cells grown in static culture do not express a robust glycocalyx, but cells grown under physiological flow conditions begin to approximate the glycocalyx observed in vivo 2. The modulus of the endothelial cell body has been measured using atomic force microscopy (AFM) to be approximately 5 to 20 kPa 5. The thickness and structure of the glycocalyx have been studied using electron microscopy 8, and the modulus of the glycocalyx has been approximated using indirect methods, but to our knowledge, there have been no published reports of a direct measurement of the glycocalyx modulus in living cells. In this study, we present indentation experiments made with a novel AFM probe on cells that have been cultured in conditions to maximize their glycocalyx expression to make direct measurements of the modulus and thickness of the endothelial glycocalyx.

The mechanical characteristics of endothelial glycocalyx were measured by indentation using micron sized spheres on AFM cantilevers. Endothelial cells were cultured in a custom chamber under physiological flow conditions to induce glycocalyx expression. Data were analyzed using a thin film model to determine the glycocalyx thickness and modulus.

כימות תכונות המכאניות של Glycocalyx האנדותל עם מיקרוסקופי כוח אטומי

Our  understanding of the interaction of leukocytes and the vessel wall during  leukocyte capture is limited by an incomplete understanding of the ...

Observing and Quantifying Fibroblast-mediated Fibrin Gel Compaction

Cells embedded in collagen and fibrin gels attach and exert traction forces on the fibers of the gel. These forces can lead to local and global reorganization and realignment of the gel microstructure. This process proceeds in a complex manner that is dependent in part on the interplay between the location of the cells, the geometry of the gel, and the mechanical constraints on the gel. To better understand how these variables produce global fiber alignment patterns, we use time-lapse differential interference contrast (DIC) microscopy coupled with an environmentally controlled bioreactor to observe the compaction process between geometrically spaced explants (clusters of fibroblasts). The images are then analyzed with a custom image processing algorithm to obtain maps of the strain. The information obtained from this technique can be used to probe the mechanobiology of various cell-matrix interactions, which has important implications for understanding processes in wound healing, disease development, and tissue engineering applications.

Time-lapse microscopy and image processing techniques were used to observe and analyze fibroblast-mediated gel compaction and fibrin fiber realignment in an environmentally controlled bioreactor over a 48 hr&#160;period.

התבוננות וכימות דחיסה של ג'ל פיברובלסט בתיווך פיברין

Cells embedded in collagen and fibrin gels attach and exert traction forces on the fibers of the gel. These forces can lead to local and global ...

Imaging Denatured Collagen Strands In vivo and Ex vivo via Photo-triggered Hybridization of Caged Collagen Mimetic Peptides

Collagen is a major structural component of the extracellular matrix that supports tissue formation and maintenance. Although collagen remodeling is an integral part of normal tissue renewal, excessive amount of remodeling activity is involved in tumors, arthritis, and many other pathological conditions. During collagen remodeling, the triple helical structure of collagen molecules is disrupted by proteases in the extracellular environment. In addition, collagens present in many histological tissue samples are partially denatured by the fixation and preservation processes. Therefore, these denatured collagen strands can serve as effective targets for biological imaging. We previously developed a caged collagen mimetic peptide (CMP) that can be photo-triggered to hybridize with denatured collagen strands by forming triple helical structure, which is unique to collagens. The overall goals of this procedure are i)&#160;to image denatured collagen strands resulting from normal remodeling activities in vivo, and ii) to visualize collagens in ex vivo tissue sections using the photo-triggered caged CMPs. To achieve effective hybridization and successful in vivo and ex vivo imaging, fluorescently labeled caged CMPs are either photo-activated immediately before intravenous injection, or are directly activated on tissue sections. Normal skeletal collagen remolding in nude mice and collagens in prefixed mouse cornea tissue sections are imaged in this procedure. The imaging method based on the CMP-collagen hybridization technology presented here could lead to deeper understanding of the tissue remodeling process, as well as allow development of new diagnostics for diseases associated with high collagen remodeling activity.

Imaging Denatured Collagen Strands In vivo and Ex vivo via Photo-triggered Hybridization of Caged Collagen Mimetic Peptides

This procedure demonstrates in vivo near IR fluorescence imaging of collagen remodeling activities in mice as well as ex vivo staining of collagens in tissue sections using caged collagen mimetic peptides that can be photo-triggered to hybridize with denatured collagen strands.

הדמיה גידים קולגן המפוגל<em&gt; בvivo</em&gt; ו<em&gt; Ex vivo</em&gt; באמצעות הכלאה-מופעל על תמונה של Caged קולגן כוזב פפטידים

Collagen is a major structural component of the extracellular matrix that supports tissue formation and maintenance. Although collagen remodeling is an ...

Helical Organization of Blood Coagulation Factor VIII on Lipid Nanotubes

Cryo-electron microscopy (Cryo-EM)1 is a powerful approach to investigate the functional structure of proteins and complexes in a hydrated state and membrane environment2.
Coagulation Factor VIII (FVIII)3 is a multi-domain blood plasma glycoprotein. Defect or deficiency of FVIII is the cause for Hemophilia type A&#160;-&#160;a severe bleeding disorder. Upon proteolytic activation, FVIII binds to the serine protease Factor IXa on the negatively charged platelet membrane, which is critical for normal blood clotting4. Despite the pivotal role FVIII plays in coagulation, structural information for its membrane-bound state is incomplete5. Recombinant FVIII concentrate is the most effective drug against Hemophilia type A and commercially available FVIII can be expressed as human or porcine, both forming functional complexes with human Factor IXa6,7.
In this study we present a combination of Cryo-electron microscopy (Cryo-EM), lipid nanotechnology and structure analysis applied to resolve the membrane-bound structure of two highly homologous FVIII forms: human and porcine. The methodology developed in our laboratory to helically organize the two functional recombinant FVIII forms on negatively charged lipid nanotubes (LNT) is described.&#160;The representative results demonstrate that our approach is sufficiently sensitive to define the differences in the helical organization between the two highly homologous in sequence (86% sequence identity) proteins. Detailed protocols for the helical organization, Cryo-EM and electron tomography (ET) data acquisition are given. The two-dimensional (2D) and three-dimensional (3D) structure analysis applied to obtain the 3D reconstructions of human and porcine FVIII-LNT is discussed. The presented human and porcine FVIII-LNT structures show the potential of the proposed methodology to calculate the functional, membrane-bound organization of blood coagulation Factor VIII at high resolution.

We present a combination of Cryo-electron microscopy, lipid nanotechnology, and structure analysis applied to resolve the membrane-bound structure of two highly homologous FVIII forms: human and porcine. The methodology developed in our laboratory&#160;to helically organize the two functional recombinant FVIII forms on negatively charged lipid nanotubes (LNT) is described.

ארגון סליל של דם קרישת פקטור VIII ביפידים צינוריות

Cryo-electron microscopy (Cryo-EM)1 is a powerful approach to investigate the functional structure of proteins and complexes in a hydrated state and ...

Electrospun Nanofiber Scaffolds with Gradations in Fiber Organization

The goal of this protocol is to report a simple method for generating nanofiber scaffolds with gradations in fiber organization and test their possible applications in controlling cell morphology/orientation. Nanofiber organization is controlled with a new fabrication apparatus that enables the gradual decrease of fiber organization in a scaffold. Changing the alignment of fibers is achieved through decreasing deposition time of random electrospun fibers on a uniaxially aligned fiber mat. By covering the collector with a moving barrier/mask, along the same axis as fiber deposition, the organizational structure is easily controlled. For tissue engineering purposes, adipose-derived stem cells can be seeded to these scaffolds. Stem cells undergo morphological changes as a result of their position on the varied organizational structure, and can potentially differentiate into different cell types depending on their locations. Additionally, the graded organization of fibers enhances the biomimicry of nanofiber scaffolds so they more closely resemble the natural orientations of collagen nanofibers at tendon-to-bone insertion site compared to traditional scaffolds. Through nanoencapsulation, the gradated fibers also afford the possibility to construct chemical gradients in fiber scaffolds, and thereby further strengthen their potential applications in fast screening of cell-materials interaction and interfacial tissue regeneration. This technique enables the production of continuous gradient scaffolds, but it also can potentially produce fibers in discrete steps by controlling the movement of the moving barrier/mask in a discrete fashion.

Here, we present a protocol to fabricate electrospun nanofiber scaffolds with gradated organization of fibers and explore their applications in regulating cell morphology/orientation. Gradients with regard to physical and chemical properties of the nanofiber scaffolds offer a wide variety of applications in the biomedical field.

Electrospun nanofiber פיגומים עם דרגות בארגון סיבים

The goal of this protocol is to report a simple method for generating nanofiber scaffolds with gradations in fiber organization and test their possible ...

Engineering 3D Cellularized Collagen Gels for Vascular Tissue Regeneration

Synthetic materials are known to initiate clinical complications such as inflammation, stenosis, and infections when implanted as vascular substitutes. Collagen has been extensively used for a wide range of biomedical applications and is considered a valid alternative to synthetic materials due to its inherent biocompatibility (i.e., low antigenicity, inflammation, and cytotoxic responses). However, the limited mechanical properties and the related low hand-ability of collagen gels have hampered their use as scaffold materials for vascular tissue engineering. Therefore, the rationale behind this work was first to engineer cellularized collagen gels into a tubular-shaped geometry and second to enhance smooth muscle cells driven reorganization of collagen matrix to obtain tissues stiff enough to be handled.
The strategy described here is based on the direct assembling of collagen and smooth muscle cells (construct) in a 3D cylindrical geometry with the use of a molding technique. This process requires a maturation period, during which the constructs are cultured in a bioreactor under static conditions (without applied external dynamic mechanical constraints) for 1 or 2 weeks. The &#8220;static bioreactor&#8221; provides a monitored and controlled sterile environment (pH, temperature, gas exchange, nutrient supply and waste removal) to the constructs. During culture period, thickness measurements were performed to evaluate the cells-driven remodeling of the collagen matrix, and glucose consumption and lactate production rates were measured to monitor the cells metabolic activity. Finally, mechanical and viscoelastic properties were assessed for the resulting tubular constructs. To this end, specific protocols and a focused know-how (manipulation, gripping, working in hydrated environment, and so on) were developed to characterize the engineered tissues.

In this work, we present a technique for the rapid fabrication of living vascular tissues by direct culturing of collagen, smooth muscle cells and endothelial cells. In addition, a new protocol for the mechanical characterization of engineered vascular tissues is described.

הנדסת ג&#39;ל קולגן Cellularized 3D לשחזור רקמות וכלי דם

Synthetic materials are known to initiate clinical complications such as inflammation, stenosis, and infections when implanted as vascular substitutes. ...

A Novel Tenorrhaphy Suture Technique with Tissue Engineered Collagen Graft to Repair Large Tendon Defects

Surgical management of large tendon defects with tendon grafts is challenging, as there are a finite number of sites where donors can be readily identified and used. Currently, this gap is filled with tendon auto-, allo-, xeno-, or artificial grafts, but clinical methods to secure them are not necessarily translatable to animals because of the scale. In order to evaluate new biomaterials or study a tendon graft made up of collagen type 1, we have developed a modified suture technique to help maintain the engineered tendon in alignment with the tendon ends. Mechanical properties of these grafts are inferior to the native tendon. To incorporate engineered tendon into clinically relevant models of loaded repair, a strategy was adopted to offload the tissue engineered tendon graft and allow for the maturation and integration of the engineered tendon in vivo until a mechanically sound neo-tendon was formed. We describe this technique using incorporation of the collagen type 1 tissue engineered tendon construct.

In this paper, we present an in vitro and in situ protocol to repair a tendon gap of up to 1.5 cm by filling it with engineered collagen graft. This was performed by developing a modified suture technique to take the mechanical load until the graft matures into the host tissue.

טכניקת תפירת טנורהאפי חדשנית עם שתל קולגן מהונדס רקמה לתיקון פגמים גדולים בגיד

Surgical management of large tendon defects with tendon grafts is challenging, as there are a finite number of sites where donors can be readily ...

Quantifying Intermembrane Distances with Serial Image Dilations

A recently-described extracellular nanodomain, termed the perinexus, has been implicated in ephaptic coupling, which is an alternative mechanism for electrical conduction between cardiomyocytes. The current method for quantifying this space by manual segmentation is slow and has low spatial resolution.We developed an algorithm that uses serial image dilations of a binary outline to count the number of pixels between two opposing 2 dimensional edges.This algorithm requires fewer man hours and has a higher spatial resolution than the manual method while preserving the reproducibility of the manual process.In fact, experienced and novice investigators were able to recapitulate the results of a previous study with this new algorithm.The algorithm is limited by the human input needed to manually outline the perinexus and computational power mainly encumbered by a pre-existing pathfinding algorithm.However, the algorithm&#39;s high-throughput capabilities, high spatial resolution and reproducibility make it a versatile and robust measurement tool for use across a variety of applications requiring the measurement of the distance between any 2-dimensional (2D) edges.

The purpose of this algorithm is to continuously measure the distance between two 2-dimensional edges using serial image dilations and pathfinding. This algorithm can be applied to a variety of fields such as cardiac structural biology, vascular biology, and civil engineering.

לכימות מרחקים Intermembrane עם תמונות טורי Dilations

A recently-described extracellular nanodomain, termed the perinexus, has been implicated in ephaptic coupling, which is an alternative mechanism for ...

Biomimetic Replication of Root Surface Microstructure using Alteration of Soft Lithography

Biomimetics is the use of chemistry and material sciences to mimic biological systems, specifically biological structures, to better humankind. Recently, biomimetic surfaces mimicking the microstructure of leaf surface, were used to study the effects of leaf microstructure on leaf-environment interactions. However, no such tool exists for roots. We developed a tool allowing the synthetic mimicry of the root surface microstructure into an artificial surface. We relied on the soft lithography method, known for leaf surface microstructure replication, using a two-step process. The first step is the more challenging one as it involves the biological tissue. Here, we used a different polymer and curing strategy, relying on the strong, rigid, polyurethane, cured by UV for the root molding. This allowed us to achieve a reliable negative image of the root surface microstructure including the delicate, challenging features such as root hairs. We then used this negative image as a template to achieve the root surface microstructure replication using both the well-established polydimethyl siloxane (PDMS) as well as a cellulose derivative, ethyl cellulose, which represents a closer mimic of the root and which can also be degraded by cellulase enzymes secreted by microorganisms. This newly formed platform can be used to study the microstructural effects of the surface in root-microorganism interactions in a similar manner to what has previously been shown in leaves. Additionally, the system enables us to track the microorganism&#8217;s locations, relative to surface features, and in the future its activity, in the form of cellulase secretion.

Biomimetics has been previously used as a tool to study leaf-microorganism interactions. However, no such tool exists for roots. Here, we develop a protocol to form synthetic surfaces mimicking root surface microstructure for the study of root-environment interactions.

שכפול של מבנה משטח שורש באמצעות שינוי של ליתוגרפיה רכה

Biomimetics is the use of chemistry and material sciences to mimic biological systems, specifically biological structures, to better humankind. Recently, ...