בפרוטוקול וידאו זה, אנו מדגימים בפירוט, מערכת תרבות לגידול oocytes בוקר. המערכת תומכת בכדאיות ה-oocytes בתרבות עד חמישה ימים ומאפשרת את ההתברמות שלהם. באמצעות מערכת תרבות זו, ביציות שנאספו זקיקי antral קטנים, אשר בדרך כלל לא משמשים פרוטוקולים סטנדרטיים עבור במבחנה בייצור, ניתן לגדל כדי להגדיל את הזמינות של גיימרים הפריה.
ניצול זה של השמורה הרחבה יותר, יכול לספק אפשרויות חדשות להצלה גנטית של מינים בסכנת הכחדה, של משפחת בקר, או של גזעים מקומיים בסיכון לשחיקה גנטית. כדי להתחיל, להכין 15 מיליליטר של תרבות בסיסית בינונית ולהשלים אותו על פי הוראות כתב היד. לאחר מכן, להכין שלושה מיליליטר של החזקת בינוני על ידי הוספת חמישה cilostamide micromolar למדיום התרבות הבסיסית ויוצקים אותו בצלחת פטרי 35 מילימטר.
הכן מדיום IVCO ארוך על ידי השלמת מדיום תרבות בסיסית על פי הוראות כתב היד. הוסיפו 200 מיקרוליטרים של מדיום IVCO ארוך לכל באר של צלחת מצופה 96 היטב. לאחר מכן מלאו את ארבעת הקצוות במים סטריליים כדי לפצות על האידוי ולשמור על לחות מתאימה במהלך התרבות.
הדגירה את צלחת 96 באר ואת המדיום החזק ב 38.5 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני עם לחות מקסימלית. לשטוף את השחלות ארבע פעמים מלוחים סטריליים, מתוחזק ב 26 מעלות צלזיוס. לאחר מכן שאפו את כל הזקיקים בקוטר של יותר משני מילימטרים, עם מחט 18 מד המחוברת למשאבת שאיפה.
תחרה השחלות שאפו בסקילר עם מלוחים סטריליים מתוחזק ב 26 מעלות צלזיוס. מניחים שחלה אחת בכל פעם על קרש חיתוך PTFE סטרילי, ולהשתמש מספר כירורגי 22 להב לחתוך פרוסות של קליפת המוח השחלות כי הם 1.5 עד שני מילימטרים עבה, במקביל לציר העיקרי של האיבר. תחרה את פרוסות קליפת השחלות בצלחת פטרי זכוכית סטרילית, עם מדיום ניתוח על צלחת חמה, ב 38.5 מעלות צלזיוס.
תחרה אחת פרוסת קליפת המוח השחלות בצלחת פטרי זכוכית 60 מילימטר, עם שניים עד שלושה מיליליטר של M199D תחת מיקרוסקופ ניתוח, לבחור את הזקיקים כי הם בין 5 לשני מילימטרים. זהה את הזקיקים הבריאים שאינם אטיים מתחת למיקרוסקופ הסטריאו, על ידי התבוננות בפרמטרים מורפולוגיים, כגון מראה שקוף בהיר באופן אחיד, כלי דם נרחבים ושכבת גרנולוזה רגילה. בעוד זקיקי atretic יש מראה אטום אפור, והם vascularized גרוע, עם COC כהה בפנים.
להשליך את זקיקי atretic ולעבד את כל האחרים. השתמש בלהב כירורגי כדי להסיר את רקמת השחלות המקיפה את הזקיק בצד אחד, עד שהוא נחשף. לאחר מכן השתמש מחט מד 26 בזהירות לעשות חריץ בקיר זקיק חשוף, אשר ישחרר את התוכן הזקיקי הכולל את COC, נוזל זקיקי, גושים של תאים.
זהה את ה- COC ובדוק אותו לשלמות קומולוס, שלמות שונה פלוצ'ידה והומוגניות של הציטופלסמה. אם קריטריונים אלה מומשו, שאף את ה- COC עם פיפטה P20. תחרה COC מבודד ב M199D cilostamide, ולהמשיך את הליך הבידוד במשך 30 דקות.
לאחר בחירת COCs, כפי שתואר קודם לכן, להכין 16 טיפות עם 20 microliters של M199D cilostamide בצלחת פטרי 60 מילימטר, ולמקם COC בריא אחד לתוך כל טיפה. השתמש במיקרוסקופ הפוך המחובר למצלמה כדי למדוד את קוטר הoocyte, למעט zona pellucida. עם הדמיה ברורה של oocyte, לבצע שתי מדידות ניצבות, להבטיח כי הממוצע של שתי המידות הוא בטווח של 100 עד 110 מיקרומטר.
זה יכול להיות קשה למדוד במדויק את קוטר oocytes, בשל תאי קומולוס המלווה. יש להשליך קוטפי COC בעלי קוציטים בקוטר קטן או גדול יותר, או שאין להם oocyte מעוגל, או כאלה עם בוציטים שאינם ניתנים למדידה. מעבירים את ה-COCs שנבחרו לצלחת של 35 מילימטר המכילה מדיום M199H, ומעבירים אותם באינקובטור בטמפרטורה של 38.5 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו-חמצני עם לחות מרבית, ודאו שזמן העבודה הכולל אינו עולה על שעתיים.
לאחר השלמת הליכי הבחירה והאיסוף, העבר COC אחד למרכז כל באר של צלחת 96 באר שהוכן בעבר. הדגירה את הצלחת במשך חמישה ימים ב 38.5 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני עם לחות מקסימלית, לרענן את המדיום כל יומיים. כדי לחדש את המדיום, החלף 100 מיקרוליטרים של מדיום ישן ב- 100 מיקרוליטרים של מדיום IVCO ארוך ורענן, עשה זאת תחת מיקרוסקופ הסטריאו כדי להימנע מהזזת ה- COCs.
בסוף IVCO ארוך, לנתח את מורפולוגיה COCs. אם יש להם השקעה קומפקטית בתא קומולוס ללא סימן של הרחבת קומולוס, או ניוון תאים, לסווג אותם כמו מחלקה אחת. אם ל- COCs יש השקעה קומפקטית בתא קומולוס ללא סימן להרחבת קומולוס או ניוון תאים, ועם תצורה אחת או יותר דמוית antrum, סווג אותם ככיתה 2.
דרגה 3 COCs, להראות מספר שכבות של תאים cumulus ללא סימן של התפשטות קומולוס, כמה תאים מפוררים בשכבה החיצונית של תאי קומולוס וללא היווצרות דמויי antrum. סווג את ה- COCs כמדרגה 4 אם הם מראים אובדן שופע של תאי קומולוס המשתרעים על פני יותר מ- 50% משטח ה- oocyte, כמו גם סימנים של ניוון תאים ופסולת תאים. בסוף IVCO ארוך המורפולוגיה ברוטו של COC משתנה.
וארבע כיתות זוהו בהתבסס על המראה של תאי קומולוס. בסך הכל נותחו 74 בוציטים בחמישה שכפולים ביולוגיים, מהם 9.45% נמחקו מהערכה נוספת. כיתות א', ב' ו-ג' נשפטו בריאות, ואילו כיתות ד' הראו סימנים ברורים של ניוון, כגון היעדר שכבות שלמות של תאי קומולוס המקיפים את הוציטים.
COCs אלה נחשבו לא מתאימים לעבור הליכים במורד הזרם בסביבה IVP פוטנציאלי. הערכה של השלב המיאוטי בסוף IVCO הארוך הראה כי אחוז גבוה משמעותית של oocytes נשאר נעצר בשלב לא בוגר, עם כרומטין עדיין סגור בתוך GV. כאשר עיבוי כרומטין בתוך GV נחקר כסמן של רווח של יכולת, המעבר של תצורת הכרומטין לשלבים מרוכזים יותר, כלומר GV 2 ו GV שלוש, נצפתה 59% של oocytes. אחוז קטן חזר meiosis להגיע metaphase שלב אחד, או ניוון.
תוצאות אלו מראות שתרבות L-IVCO תומכת בכדאיות ה-oocyte, תוך מניעת חידוש מיוטי למשך חמישה ימים. בסוף IVCO ארוך, COCs ניתן להשתמש בהליכים במורד הזרם של ייצור עובר במבחנה, כלומר, הבשלה במבחנה, הפריה, ותרבות העובר. צעדים אלה נחוצים כדי לספק הוכחת מושג כי oocyte רכשו יכולת התפתחותית גבוהה יותר.
מלבד החזקת הפוטנציאל של הגדלת כמות ביציות הפריה, מערכת התרבות IVCO הארוכה היא כלי עבור מדענים המעוניינים לנתח את התהליכים התאיים והמולקולריים המווסתים את היווצרותו של גמטה מוכשר.
