על ידי גרימת מוטציות נקודתיות ביעילות באמצעות עורך בסיסי ציטוסין בתיווך CRISPR, ניתן לזהות את הפונקציונליות של גרסאות BRCA1, החשובה למניעת מחלות ואבחון. היתרון של טכניקה זו הוא שזה ישירות מוטציות אנדוגני לידי ביטוי BRCA1, אשר מתגבר על המגבלה של הערכה תפקודית באמצעות BRCA1 מבוטא אקסוגני. זיהוי של אובדן מוטציות תפקודיות של BRCA1 יכול לשמש כדי לחזות את הסיכוי לפתח סרטן הקשורים מוטציות BRCA1, כגון השד, השחלות, הערמונית, סרטן הלבלב.
זה יכול לשמש גם למציאת מטרות סמים פוטנציאליות על ידי חיפוש גנים חיוניים אשר הכדאיות מצטמצמת באמצעות דלדול תפקודי. כדי להתחיל, להשיג את רצף הגנום BRCA1 מ GenBank ב NCBI ולחפש את 20 בסיסי זוג אתרי היעד עם רצף המוטיב הסמוך protospacer, NGGNCCN, סביב מוטציה של עניין. המוטציה של עניין צריך להיות ממוקם בתוך ארבעה עד שמונה נוקלאוטידים בקצה PAM-distal של רצפי היעד RNA המדריך.
הזמינו שני אוליגונוקלאוטידים חינם לכל מדריך RNA. עבור oligonucleotides קדימה, להוסיף CACCG לסוף 5 של רצף מדריך עבור oligonucleotides הפוך, להוסיף AAC 5'end ו- C לסוף 3'. לאחר קבלת האוליגונוקלאוטידים, יש לוותר עליהם במים מזוקקים לריכוז סופי של 100 מיקרומולאר.
מערבבים את שני אוליגונוקלאוטידים חינם לריכוז סופי של 10 מיקרומולאר עם חיץ קשירה T4 ומחממים אותם ל 95 מעלות צלזיוס במשך חמש דקות ואז לקרר אותם לטמפרטורת החדר עבור חישול. לעכל pRG2 באמצעות אנזים ההגבלה Bsa1 במשך שעה אחת ב 37 מעלות צלזיוס, ולאחר מכן להפעיל את המוצר מתעכל על 1%agarose ג'ל לטהר את הלהקה בגודל המתאים. Ligate דופלקס oligonucleotide annealed לדנ"א וקטור באמצעות ליגאז DNA שנרכשו על פי פרוטוקול היצרן ולהפוך אותם לתאים מוסמכים DH5-אלפא.
מוסיפים את המשנה לצלחת אגר המכילה 100 מיקרוגרם לאמפיצילין מיליליטר ומדגרים את הצלחת במשך הלילה ב-37 מעלות צלזיוס. לטהר DNA פלזמה מכמה transformants ולנתח רצפי RNA המדריך שלהם על ידי רצף סנגר עם פריימרים כי הממשלה ב מקדם U6. זרעים חמש פעמים 10 לתאי HAP1-BE3 החמישיים לבאר בצלחות של 24 באר יום אחד לפני ההדבקה והתרבות שלהם כדי להגיע 70 עד 80% ממתקים עבור transfection.
Transfect BRCA1 מדריך מיקוד RNAs באמצעות ריאגנטים transfection שנרכשו על פי פרוטוקול היצרן. השתמש מיקרוגרם אחד של RNAs מדריך פילוח BRCA1 כדי לגרום CG כדי ת"א המרה באתרי היעד BRCA1 ואז דגירה התאים ב 37 מעלות צלזיוס ותת תרבות כל שלושה עד ארבעה ימים. לקצור את כדורי התא שלושה, 10 ו 24 ימים לאחר transfection לנתח יעילות עריכת בסיס.
לחלץ DNA גנומי באמצעות ערכת טיהור DNA גנומי. תכנן את פריימרים PCR הראשונים כדי להגביר את אתרי היעד BRCA1. למרות שאין הגבלה על הגודל של מוצר PCR הראשון, גודל מוצר של פחות מ קילו-בייס אחד מומלץ להגביר ביעילות אזור מסוים.
עיצוב פריימרים PCR השני ממוקם בתוך המוצר PCR הראשון, תוך התחשבות בגודל של amplicon על פי אורך הקריאה NGS. על מנת לצרף רצפים חיוניים לניתוח NGS, להוסיף רצפים נוספים 5'קצוות של פריימרים PCR השני. להגביר את אתרי היעד BRCA1 על ה-DNA הגנומי המתקבל משלוש נקודות הזמן באמצעות פולימראז נאמנות גבוהה.
לתגובת PCR הראשונה, השתמש 100 ננוגרם של DNA גנומי להגברה מעל 15 מחזורים. לתגובת PCR השנייה, השתמש במיקרוליטר אחד של מוצר ה- PCR הראשון להגברת מעל 20 מחזורים. הפעל חמישה מיקרוליטרים של מוצר PCR השני על 2%agarose ג'ל ולאשר את הגודל.
לאחר מכן צרף את הרצפים החיוניים לניתוח NGS על ידי הגברת מוצר PCR השני באמצעות פריימרים המפורטים בכתב היד טקסט. הגבר כל דגימה באמצעות ערכות פריימר שונות. השתמש במיקרוליטר אחד של מוצר PCR השני למשך עד 30 מחזורי הגברה עם פולימראז בעל אמינות גבוהה.
הפעל חמישה מיקרוליטרים של מוצר PCR על 2%agarose ג'ל כדי לאשר את הגודל ולטהר את האמפליקון באמצעות ערכת ניקוי PCR מסחרית. ערבבו כל דגימה בכמויות שוות ליצירת ספריית NGS. לכמת את ספריית NGS באמצעות ספקטרופוטומטר ולדלל אותו לריכוז של ננומולאר אחד באמצעות חיץ ההשעיה או 10 מילימולאר Tris-HCl ב pH 8.5.
הכינו 100 מיקרוליטרים של הספרייה מדוללים לריכוז הטעינה המתאים. כפקד שילב PhiX עם מדגם מדולל. טען את הספריה על המחסנית והפעל NGS בהתאם לפרוטוקול היצרן.
השג מעל 10,000 קריאות לפי אמפליקון יעד לניתוח מעמיק של יעילות העריכה הבסיסית. פרוטוקול זה שימש לביצוע הערכה תפקודית של גרסאות BRCA1 אנדוגניות שנוצרו על ידי עורכי בסיס ציטוסין מבוססי CRISPR. CAS-9 ומדריך RNAs הוכנסו לקווי תא HAP1 כדי לשבש את BRCA1, ותדרי מוטציה נותחו.
תדרי מוטציה ירדו באופן משמעותי לאורך זמן בקווי התא HAP1, המציין כי BRCA1 הוא גן חיוני עבור הכדאיות של התא בתאים אלה. כדי לחקור אם CG ל TA הוחלף וריאנטים להשפיע על הפונקציה של BRCA1, פלסמידים DNA ומדריך קידוד RNAs שיכול לגרום לכל מוטציה היו transfected יש קווי התא HAP1-BE3. ותדרי ההחלפה נותחו.
תדרי ההחלפה היחסיים של 3598C ל- T, גרסה פתוגנית שגורמת למוטציה שטותית, ירדו באופן דרמטי. בעוד אלה של 4527C כדי T, גרסה שפירה שגורמת מוטציה שטויות, נשאר דומה עם הזמן. נמצא כי תדרי החלפת נוקלאוטידים של שלוש גרסאות אלה ירדו באופן תלוי זמן.
מכיוון שיש צורך להשיג תדירות מוטציה ראשונית גבוהה על מנת לזהות בבירור את השינוי בכדאיות התא עם חלוף התאריך, זוהי עדיפות לקבוע תנאים מותאמים transfection. ניתן להחיל הליך זה לאימות וריאנטים גנטיים לא ידועים אחרים כגון BRCA VUS. זה עשוי לספק רמזים לפתוגניות של וריאנטים לא ידועים שמקורם בחולה והטיפול בהם.
