המטרה הכוללת של מחקר זה היא להראות כיצד ליישם הליכים אוטומטיים עבור culturing והתמעטיות תאי IPS אנושיים לתוך שושלת עצבית, כמו גם הדמיה אוטומטית שלהם. הליכים אוטומטיים מתוקנים מאפשרים שונות ניסיונית נמוכה תוך הבטחת רבייה פנוטיפית גבוהה. בנוסף, ניתן להתאים את המערכת לפיתוח פרוטוקולים חדשים.
להדגים את הנהלים יהיו יואכים תגר ואליזנגלה ברסן, פוסט-דוקטורט מהמעבדה שלנו. בממשק המשתמש הגרפי של המערכת האוטומטית, לחץ על תצוגת תהליך של כלי משאבים ובחר את תהליך כלי המשאב. לחץ על הפעל תהליך כלי ולהפעיל את מכסה המנוע HEPA לרוץ ותהליכי טעינה מחדש.
בחר את המשאבים שיש לטעון, פתח את הדלת וטען את לוחות תרבות התאים ואת העצות החד-פעמיות במיקומים המתאימים כפי שמציינת התמונות המוקפצות. לאחר מכן לטהר את הדלת עם 70% אתנול לפני הסגירה ולהפעיל את תהליך הטיהור. המערכת תהיה מעוקרת על ידי קרינת UV במשך 30 דקות.
כדי לטעון את הצלחות עם מדיום תרבות או דיסוציאציה reagent, לבצע את הצעד לרוץ HEPA מכסה המנוע ולפתוח את הדלת של תחנת הטיפול בנוזל. לאחר טיהור עם 70% אתנול, מניחים את המאגרים על הסיפון למיקום שהוקצה ו de-lid אותם. סגור את הדלת של תחנת הטיפול בנוזלים, ולאחר מכן הפעל את תהליך כלי המשאבים InitHepaHood כדי להפעיל את מכסה המנוע של HEPA.
כדי לבצע שיטת תרבות אוטומטית, בתצוגת לוח השנה של ממשק המשתמש הגרפי, לחץ על הוסף שלב תהליך ובחר את קו התא שישמש בניסוי. השתמש באשף כדי לבחור את הפרוייקט ולסמן את האצווה לשימוש. לחץ על ראש החץ הפונה ימינה ונווט אל העמוד הבא של האשף כדי לבחור את שלב התהליך שיש לבצע.
בעמוד האחרון של האשף, תזמן את הניסוי והגדר את הפרמטרים המתאימים מפרט משתנים הדרושים להפעלת פעולת השירות. לאחר מכן לחץ על אישור. לאחר טעינת צינור 50 מיליליטר עם ההשעיה תא IPS האנושי, לטעון צלחות תרבות מצופה לקבלת התאים על המדף ולבצע את זריעת צלחות משיטת צינורות. כדי לספור את התאים בציטומטר ההדמיה של ברייטפילד, הכינו אוטומטית לוח ספירה של 384 בארות עם מתלי תאים על הסיפון ולהשתמש בזרוע הרובוטית כדי להעביר את לוח הספירה של 384 הבאר מהסיפון לציטומטר ההדמיה של ברייטפילד.
לאחר הספירה, המערכת תחזיר את הצלחת למיקום המקורי שלה ותעביר תרבות מצופה או צלחת בדיקה מהמדף לסיפון הצינור. לאחר מכן המערכת תזרע את התאים במספר ובנפחים המוגדרים על-ידי המשתמש המתאימים לצלחת ותערבב על ידי צינורות. לאחר הזריעה, הצלחת תועבר לשייקר על הסיפון למשך 10 שניות במהירות של 500 מהפכות לדקה לחלוקת תאים לפני שתועבר לאנקובטור הפחמן הדו-חמצני.
כדי להעריך את ההתכנסות האוטומטית, בצע את שיטת בדיקת הקונפלונציה ובחר אצווה המכילה לפחות לוחית תרבות אחת וללא לוחיות בדיקה. במקטע פרטי הפרמטרים, הזן iPSCf_2020 עבור רכישת תמונה בהגדרות ניתוח ההדמיה. לאחר מכן המערכת תעביר את הלוחית הראשונה מהאינקובטור לציטומטר ההדמיה של ברייטפילד ותדמית את התכנסות התאים.
כדי לשנות את תרבות התאים או להמתן מדיה של לוחיות, בצע את שינוי המדיה של שיטת לוחות התרבות ובחר אצווה המכילה לוחות תרבות בלבד. המערכת תעביר את הצלחות לסיפון ותטה את הצלחות כדי לאפשר שאיפה של העל-טבעי. העל-טבעי יושלך למודול איסוף הפסולת ויזרוק את הטיפים ו-12 מיליליטר של מדיום טרי יתווספו לכל צלחת.
לאחר מכן המערכת תכסה מחדש את הצלחות ותחזיר את הצלחות לאנקובטור של תרבות התאים. לחלופין, כדי לשנות את המדיום של לוחות מים, לבצע שינוי מדיה של שיטת צלחות מיסטית. כדי לתת משנה לתאים, בצע את תת-התרבות של פעולת השירות של תאים חסידים ובחר את האצווה המכילה את לוחות התרבות הזקוקים לתת-תרבות.
לאחר השלכת המדיום, המערכת תשטוף את התאים פעם אחת עם שמונה מיליליטר של PBS לכל צלחת לפני הוספת שמונה מיליליטר של 0.5 מילימולאר EDTA לתאים. לאחר שמונה דקות על הסיפון עם אפשרות הטיה, EDTA יוחלף עם 12 מיליליטר של בינוני טרי לכל צלחת. המערכת תנער את הלוחות ב 2, 000 מהפכות לדקה במשך דקה אחת כדי לנטרל את המושבות לפני triturating התאים עם חמישה מחזורים של pipetting כדי לשבור את המושבות לתוך 50 עד 80 גושים מיקרון.
לאחר מכן התאים יועברו לצינור של 50 מיליליטר על הסיפון לפני שהם זורעים אותם ביחס פיצול של 1 עד 7. עבור תוכן גבוה אוטומטי, הדמיית תאי תפוקה גבוהה, בצע את שיטת ההדמיה ובחר אצווה המכילה לפחות לוחית מים אחת וללא לוחות תרבות. לאחר מכן המערכת תעביר לוחית בדיקה למיקרוסקופ הקונפוקל האוטומטי להדמיה.
הקפד לבחור את מזהי האצווה והצלחות הנכונים בעת ביצוע שלבי התהליך הנדרשים. תרבויות hiPSC צריך להיות במעקב יומי לצמיחה וניתוח עבור אחוז הקונפדרציה שלהם בציטומטר הדמיה Brightfield. לאחר מעבר ותרבות מערכת ידנית או אוטומטית, התאים מציגים תא גזע טיפוסי וביטוי סמן פלוריפוטנציה.
נוירונים המובדלים במערכת התרבות האוטומטית מדגימים מורפולוגיה דומה וארגון רשת עצבי לנוירונים המעובדים באופן ידני. לאחר שישה ימים של הבחנה, נוירונים קליפת המוח מובחנים באופן אוטומטי הם חיוביים עבור נוירון ספציפי סוג III בטא-tubulin וביטוי סמן שכבה קליפת המוח העליונה. לאחר שמונה ימים, התאים גם הביעו חלבון הקשורות microtubule 2, מולקולת הידבקות בתא העצבי, סינפסין אני, כמו גם סמני נוירון קליפת המוח.
נמוך מאוד או לא ביטוי של סמנים אלה נצפתה hiPSC. מערכת זו יכולה לשמש גם כדי להקים תא חי אוטומטי neurite תבצר בדיקה המאפשרת אורכי neurite להימדד על פני 11 ימים של בידול ללא התערבות ידנית. שימוש במערכת התרבות האוטומטית לביצוע שינויים בינוניים לאורך תקופת תרבות של 65 יום מאפשר התביור hiPSC לנוירונים דופאמין midbrain עם הארגון התאי הצפוי מורפולוגיה.
בנוסף לתפוקת הנוריט, ניתן לחקור בדיקות פנוטיפיות אוטומטיות אחרות הרלוונטיות לחקר ניוון עצבי, לדוגמה, פוצ'י RNA טרנסלוקציה TDP-43 וקליטת פיבריון אלפא-סינוקליין, באמצעות תפוקה גבוהה זו, פורמט תוכן גבוה.
