E.A.B. נתמך על ידי המכונים הלאומיים לבריאות (1F31HL140850), קרן ARCS, Inc., סן דייגו פרק, והוא ריס-Stealy קרן המחקר פיליפס Gausewitz, MD חוקר של מכון הלב SDSU. E.A.B ו-A.S.B נתמכו על ידי קרן אינמורי. CCG על ידי (NIH) מעניק R01 HL135893, R01 HL141463 ו HL149931.

<ol>
	<li>Peter, A. K., Bjerke, M. A., Leinwand, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biology+of+the+cardiac+myocyte+in+heart+disease.">Biology of the cardiac myocyte in heart disease.</a> Molecular Biology of the Cell. 27 (14), 2149-2160 (2016).</li><li>Kruppenbacher, J. P., May, T., Eggers, H. J., Piper, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiomyocytes+of+adult+mice+in+long-term+culture.">Cardiomyocytes of adult mice in long-term culture.</a> Naturwissenschaften. 80 (3), 132-134 (1993).</li><li>Ackers-Johnson, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Simplified,+Langendorff-Free+Method+for+Concomitant+Isolation+of+Viable+Cardiac+Myocytes+and+Nonmyocytes+From+the+Adult+Mouse+Heart.">A Simplified, Langendorff-Free Method for Concomitant Isolation of Viable Cardiac Myocytes and Nonmyocytes From the Adult Mouse Heart.</a> Circulation Research. 119 (8), 909-920 (2016).</li><li>Jin, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATF6+decreases+myocardial+ischemia/reperfusion+damage+and+links+ER+stress+and+oxidative+stress+signaling+pathways+in+the+heart.">ATF6 decreases myocardial ischemia/reperfusion damage and links ER stress and oxidative stress signaling pathways in the heart.</a> Circulation Research. 120 (5), 862-875 (2017).</li><li>Judd, J., Lovas, J., Huang, G. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+Culture+and+Transduction+of+Adult+Mouse+Cardiomyocytes.">Isolation, Culture and Transduction of Adult Mouse Cardiomyocytes.</a> Journal of Visualized Experiments. (114), e54012 (2016).</li><li>Li, D., Wu, J., Bai, Y., Zhao, X., Liu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+Culture+of+Adult+Mouse+Cardiomyocytes+for+Cell+Signaling+and+in+vitro+Cardiac+Hypertrophy.">Isolation and Culture of Adult Mouse Cardiomyocytes for Cell Signaling and in vitro Cardiac Hypertrophy.</a> Journal of Visualized Experiments. (87), e51357 (2014).</li><li>O'Connell, T. D., Ni, Y. G., Lin, K. M., Han, H. P., Yan, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+adult+cardiac+myocytes+for+signaling+studies.">Isolation and culture of adult cardiac myocytes for signaling studies.</a> AfCS Research Reports. 1 (5), 1-9 (2003).</li><li>Pinz, I., Zhu, M., Mende, U., Ingwall, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improvised+isolation+procedure+for+adult+mouse+cardiomyocytes.">An improvised isolation procedure for adult mouse cardiomyocytes.</a> Cell Biochemistry and Biophysics. 61 (1), 93-101 (2011).</li><li>Piper, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culturing+of+calcium+stable+adult+cardiac+myocytes.">Culturing of calcium stable adult cardiac myocytes.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 14 (7), 397-412 (1982).</li><li>Shioya, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+technique+for+isolating+healthy+heart+cells+from+mouse+models.">A simple technique for isolating healthy heart cells from mouse models.</a> Journal of Physiological Sciences. 57 (6), 327-335 (2007).</li><li>Omatsu-Kanbe, M., Yoshioka, K., Fukunaga, R., Sagawa, H., Matsuura, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+antegrade+perfusion+method+for+isolating+viable+single+cardiomyocytes+from+neonatal+and+aged+mice.">A simple antegrade perfusion method for isolating viable single cardiomyocytes from neonatal and aged mice.</a> Physiological Reports. 6 (9), 13688 (2018).</li><li>Jansen, H. J., Rose, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+Atrial+Myocytes+from+Adult+Mice.">Isolation of Atrial Myocytes from Adult Mice.</a> Journal of Visualized Experiments. (149), e59588 (2019).</li><li>Yao, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+Cardiomyocyte+NLRP3+Inflammasome+Signaling+Promotes+Atrial+Fibrillation.">Enhanced Cardiomyocyte NLRP3 Inflammasome Signaling Promotes Atrial Fibrillation.</a> Circulation. 138 (20), 2227-2242 (2018).</li><li>Cha, Y., Redfield, M. M., Shen, W., Gersh, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atrial+Fibrillation+and+Ventricular+Dysfunction:+A+Vicious+Electromechanical+Cycle.">Atrial Fibrillation and Ventricular Dysfunction: A Vicious Electromechanical Cycle.</a> Circulation. 109 (23), 2839-2843 (2004).</li><li>Issa, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Left+atrial+size+and+heart+failure+hospitalization+in+patients+with+diastolic+dysfunction+and+preserved+ejection+fraction.">Left atrial size and heart failure hospitalization in patients with diastolic dysfunction and preserved ejection fraction.</a> Journal of Cardiovascular Echography. 27 (1), 1-6 (2017).</li><li>de Bold, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atrial+natriuretic+factor:+a+hormone+produced+by+the+heart.">Atrial natriuretic factor: a hormone produced by the heart.</a> Science. 230 (4727), 767-770 (1985).</li><li>McGrath, M. F., de Bold, M. L., de Bold, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+endocrine+function+of+the+heart.">The endocrine function of the heart.</a> Trends in Endocrinology and Metabolism. 16 (10), 459-477 (2005).</li><li>Doevendans, P. A., Daemen, M. J., de Muinck, E. D., Smits, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiovascular+phenotyping+in+mice.">Cardiovascular phenotyping in mice.</a> Cardiovascular Research. 39 (1), 34-49 (1998).</li><li>Banerjee, I., Fuseler, J. W., Price, R. L., Borg, T. K., Baudino, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+cell+types+and+numbers+during+cardiac+development+in+the+neonatal+and+adult+rat+and+mouse.">Determination of cell types and numbers during cardiac development in the neonatal and adult rat and mouse.</a> American Journal of Physiology. 293, 1883-1891 (2007).</li><li>Jugdutt, B. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ventricular+remodeling+after+infarction+and+the+extracellular+collagen+matrix:+when+is+enough+enough.">Ventricular remodeling after infarction and the extracellular collagen matrix: when is enough enough.</a> Circulation. 108, 1395-1403 (2003).</li><li>Omatsu-Kanbe, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+cardiac+progenitors+that+survive+in+the+ischemic+human+heart+after+ventricular+myocyte+death.">Identification of cardiac progenitors that survive in the ischemic human heart after ventricular myocyte death.</a> Scientific Reports. , 7 (2017).</li><li>Song, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heart+repair+by+reprogramming+non-myocytes+with+cardiac+transcription+factors.">Heart repair by reprogramming non-myocytes with cardiac transcription factors.</a> Nature. 485, 599-604 (2012).</li><li>Limana, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=bcl-2+overexpression+promotes+myocyte+proliferation.">bcl-2 overexpression promotes myocyte proliferation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99, 6257-6262 (2002).</li><li>Pinto, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revisiting+cardiac+cellular+composition.">Revisiting cardiac cellular composition.</a> Circulation Research. 118 (3), 400-409 (2015).</li><li>Chen, W., Frangogiannis, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+inflammatory+and+fibrogenic+pathways+in+heart+failure+associated+with+aging.">The role of inflammatory and fibrogenic pathways in heart failure associated with aging.</a> Heart Failure Reviews. 15, 415-422 (2010).</li><li>Daly, M. J., Elz, J. S., Nayler, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contracture+and+the+calcium+paradox+in+the+rat+heart.">Contracture and the calcium paradox in the rat heart.</a> Circulation Research. 61 (4), 560-569 (1987).</li><li>Li, Z., Sharma, R. V., Duan, D., Davisson, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenovirus-mediated+gene+transfer+to+adult+mouse+cardiomyocytes+is+selectively+influenced+by+culture+medium.">Adenovirus-mediated gene transfer to adult mouse cardiomyocytes is selectively influenced by culture medium.</a> Journal of Gene Medicine. 5 (9), 765-772 (2003).</li></ol>

למחברים אין מה לחשוף.

איכות התאים המבודדים באמצעות ההליך המתואר כאן, כפי שנקבע על ידי תשואת התא ובריאות כללית של התאים בתרבות, תלויה בגורמים רבים לשליטה. החל עם העכבר עצמו, זה תועד כי הלחץ שהוטל על החיה יכול להשפיע לרעה על תשואת התא ואת הכדאיות בתרבות, ככל הנראה בשל עודף קורטיזול מערכתי, קטכולאמינים, ואת המצב hypercontractile של רקמת לב2,5,7. מסיבות אלה, יש לנקוט צעדים כדי למנוע הבהבת החיה לפני ההקרבה. אמצעים אלה כוללים כיסוי הכלוב של החיה והגבלת זמן מחוץ vivarium לפני ההקרבה. הפרין וברביטורטים רבים המשמשים בדרך כלל המתת חסד יכולים להשפיע על מסלולי איתות; לפיכך, יש להתאים אישית את השיטה האופטימלית של המתת חסד בהתאם. לגיל החיה יש השפעה ניכרת על האיכות והכדאיות של תאים מבודדים, ככל הנראה עקב הצטברות מתקדמת של פיברוזיס ביניים המתרחשים במקביל לתהליך ההזדקנות, אשר יכול להשפיע על עיכולרקמות 25. בנתונים שאינם מוצגים כאן, בעוד שהשיטה המתוארת לעיל פועלת בעכברים בני עד 78 שבועות, איכות התאים הייתה נמוכה יותר בבעלי חיים מבוגרים אלה.
הצעד הקריטי ביותר בתהליך הבידוד המתואר, כמו גם פרוטוקולים אחרים הכוללים מנגנון לנגנדורף לזלוף מדרדר, הוא הקנציה והזלוף הראשוני של הלב. לקבלת תוצאות אופטימליות, הזמן מ explantation לב כדי שימורים של העורקים העולה חניכה של זלוף צריך לקחת לא יותר מ 90 s. בנוסף לזמן, שני גורמים חשובים נוספים הם עומק הצינורית ואפשרות להכניס אמבולי אוויר ממנגנון הזלוף. לפיכך, יש לקדם את הצינורית לתוך אבי העורקים העולה כדי לא להיכנס לשורש אבי העורקים ולחסום את שסתום אבי העורקים, אשר יפגע בזלוף כלי הדם הכליליים.
במהלך תהליך העיכול, חשוב לבדוק באופן קבוע את קשיחות הלב, כדי למנוע חשיפה ממושכת לקולאזנאז אנזים העיכול, אשר מפחית סובלנות סידן מיוציטים לב. הפרוטוקול שתואר לעיל להחזרת סידן לתרביות מיוציטים חדריות מבודדות נועד להגביל מוות מיוציטים לבביים באמצעות זרם סידן בלתי הולם באמצעות ערוצי סידן המופעלים בחנות. יש לציין כי החזרת הסידן החורגת לא צריכה להתבצע עבור תרבויות מיוציטים בין-תאיות מבודדות, שכן זה יקדם מוות תאי במהלך תרבות לטווח קצר וארוך12. לאמצעי זהירות נוספים, מאגרי זלוף ועיכול המשמשים כאן כוללים את מעכב התכווצות שריר הלב butanedione monoxime (BDM) כדי למנוע היפרcontraction של מיוציטים מבודדים, כמו גם את פרדוקס הסידן, שניהם משפיעים על הכדאיות myocyte26. עם זאת, יש לציין את המעבר מ- BDM לבביסטין, שכן הוא הסוכן האנטי-התכווצות המועדף בשמירה על מדיה עבור מיוציטים לבביים מבודדים. בנתונים שאינם מוצגים, blebbistatin מעניק כדאיות רבה יותר לתרבות ארוכת טווח של מיוציטים לבביים מבודדים.
מיד לאחר הבידוד, חשוב לשקול את ההשלכות של תרבות ארוכת טווח של תאי לב, במיוחד מיוציטים. הבידוד הלבבי שאינו מיוציטים ופרוטוקול culturing המתואר כאן מבוסס על שיטות נפוצות המנצלות את הצפיפות ותכונות הדבק השונות של תאי לב שונים. היתרון של מיוציטים שאינם מיוציטים הוא פוטנציאל ההתרחבות הגבוה שלהם בתרבות; לפיכך, שלא כמו מיוציטים לבביים, הם נוחים להנצחה. עם זאת, ידוע כי culturing תנאים, כולל תוספי בינוני עם FBS, יכול להשפיע על תפקוד מיוציטים לב27. המדיה התרבותית המתוארת כאן נועדה לייעל את הכדאיות ולהגביל את ההפרעות התפקודיות, במיוחד עבור מיוציטים בין-וסתיים מבודדים. בעוד שלא נצפתה יכולת התכווצות לקויה במיציטים לבביים מבודדים לאחר התרבות בהיעדר תוספי blebbistatin, מחקרים המתמקדים באלקטרופיזיולוגיה, התכווצות, ותא יחיד אחר באיתות מולקולרי מבוסס vivo צריכים להתבצע זמן קצר לאחר הבידוד, כאשר המבנה הסרקומי והחתימה המולקולרית עדיין מחקים את זה של הלב שלם.
מאפיין בולט של מיוציטים פרוזדורים הוא היכולת שלו לאור ירח כתא אנדוקריני עם יכולת הפרשה עצומה, בנוסף לתפקודם המתכווץ. בתנאים פיזיולוגיים, מיוציטים פרוזדוריים מייצרים כמויות גדולות של ANP, המאוחסן ברשתית האנדופלזמית ובגרגרי הפרשה גדולים בעלי ליבה צפופה הצפויים לאקסוציטוזיס מוסדר עם קבלתגירוי 16,17. בעוד שמחקרי מיוציטים אסציוניים מבודדים רבים מתמקדים בתכונות האלקטרופיזיולוגיות הייחודיות שלהם, זהו המחקר הראשון שמתכנן מדיה תרבותית. זה מאפשר הכדאיות לטווח ארוך, כמו גם קידום של הפונקציות המתוחזקות של תכונות אנדוקריניות והתכווצות של מיוציטים אסטראליים. שיטה חדשנית זו עבור culturing, כמו גם בידוד בו זמנית של כל סוגי התאים מתוך תאים אבריים חדריים מלב עכבר יחיד, יהיה שימושי ויעיל למחקרים על המאפיינים הפיזיולוגיים והפתופיזיולוגיים של מיוציטים בין אבות וחדריים כאחד.

תרבות התאים העיקרית היא משאב אינטגרלי המציע סביבה מבוקרת למחקרים מכניסטיים מפורטים של תפקוד מיוציטים לבביים. בשל האופי העמיד יותר שלהם וקלות הבידוד, ארוסת עכברוש יילודים ומיוציטים חדריים היו המקור המשותף לתרביות תאים כאלה1. עם זאת, מיוציטים של עכברים בוגרים חדריים (AMAMs ו- AMVMs) רצויים מאוד למחקרים במבחנה, מכיוון שהמאפיינים המולקולריים והתפקודיים שלהם מחקים טוב יותר את אלה של תאי לב בוגרים. לכן, הם הפכו רלוונטיים למחקרים הקשורים פתולוגיות לב, שרובם מתפתחים אצל מבוגרים2.
יתר על כן, הזמינות והשימוש במודלים של עכברים מהונדסים ומחלות מרחיבים את התועלת של מיוציטים לבביים בוגרים מבודדים. פרוטוקולים לבידוד ותרבות העכבר AMVMs למחקרים קצרי טווח וארוכי טווח תוארו בפרסומים קודמים רבים2,3,4,5,6,7,8,9,10,11. לשם השוואה, פרוטוקולים מעטים תוארו לבידוד של AMAMs. יתר על כן, אלה המתוארים מותאמים בעיקר למחקרים חריפים של תאים מבודדים טריים, ללא פרוטוקול culturing לטווח ארוך המתואר עד כה11,12,13. ככזה, פרוטוקולי בידוד AMAM לא נועדו לספק את השירות ואת צדדיות של פרוטוקולים שפורסמו עבור הבידוד והתרבות של AMVMs. יתר על כן, בעוד המחקרים החלוציים לבידוד של AMAMs ו- AMVMs הוכיחו תושייה, אין פרוטוקולים לבידוד ותרבות אופטימליים בו זמנית של AMAMs ו- AMVMs, מה שמוביל לשימוש יעיל בלב כולו לכל הכנה.
עד כה, פרוטוקולי בידוד AMAM ו- AMVM שפורסמו לא תוכננו לבידוד בו זמנית של שני סוגי התאים, מכיוון שלרוב המחקרים על תפקוד פרוזדור וחדר יש מיקוד ספציפי לתא. לדוגמה, AMAMs משמשים בעיקר כדי ללמוד אלקטרופיזיולוגיה מיוציטים פרוזדורים, בין היתר בגלל העניין פרפור פרוזדורים (AF), הפרעות קצב הלב הנפוצות ביותר בארה"ב. עם זאת, AF אינה מחלה המשפיעה על atria בבידוד, וזה כבר מעורב כבעל תפקיד סיבתי קל עד חמור תפקוד לקוי של החדר השמאלי14. יתר על כן, אלקטרוקרדיוגרמות מחולים עם אי ספיקת לב עם שבר פליטה משומר (HFpEF) הוכיחו כי גודל האבסורד השמאלי הוא אחד המנבאים החזקים ביותר עבור רגישות לאי ספיקת לב15.
בנוסף לתפקידו באלקטרופיזיולוגיה והתכווצות, האטריום הוא גם איבר אנדוקריני, מפריש קרדיוקינים (כלומר, פפטיד נטריורי פרוזדורי [ANP]) המווסת באופן הומיאוסטטי את לחץ הדם ואת נפח16,17. יתר על כן, ANP (ככל הנראה מ myocytes אבריאלי) יש תפקיד מגן בולט אנטי היפרטרופי מיוציטים חדריים16,17. אמנם יש השלכה חזקה של תקשורת נוירוהורמונלית בין atria ו ventricles במצבי מחלה שונים, המנגנונים שבבסיס תקשורת זו לא נחקרו במלואם. נקודה זו באה לידי ביטוי עוד יותר על ידי גל המחקר המתמקד 1) התפקיד של שאינם מיוציטים (במיוחד fibroblasts לב ותאי החיסון) בלב החולה ו 2) איך שיפוץ לב כפונקציה של מחלה משפיע ישירות על הכדאיות מיוציטים לב ותפקוד לב גלובלי18,19,20,21,22. לכן, לימוד תאי לב הן atria והן חדרים היא גישה הכרחית כדי לקבל תמונה מלאה יותר של תפקידם פתופיזיולוגיה לב.
הפרוטוקול הבא מתאר את הבידוד הסימולטני של מיוציטים ובלתי מיוציטים בין-חדריים ולא מיוציטים מלב עכבר יחיד בתנאים פיזיולוגיים ופתופיזיולוגיים. בנוסף, שיטה זו היא הראשונה לתאר את התנאים האופטימליים הדרושים לשמירה על תרבויות של מיוציטים לב פרך, כמו תנאים לשמירה על תרבויות של מיוציטים חדריים כבר פורסמו.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:668px;" width="669">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">(-)-Blebbistatin</td>
			<td style="width:175px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:116px;">B0560</td>
			<td style="width:163px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">1 Liter Water Jacketed Reservoir</td>
			<td style="width:175px;">Radnoti</td>
			<td style="width:116px;">120142-1</td>
			<td style="width:163px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">2,3-Butanedione monoxime</td>
			<td style="width:175px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:116px;">B0753</td>
			<td style="width:163px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">5-0 Silk Suture Thread</td>
			<td style="width:175px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:116px;">18020-50</td>
			<td style="width:163px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Adenosine</td>
			<td style="width:175px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:116px;">A9251</td>
			<td style="width:163px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Bovine Serum Albumin</td>
			<td style="width:175px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:116px;">A6003</td>
			<td style="width:163px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Bubble Trap Compliance Chamber</td>
			<td style="width:175px;">Radnoti</td>
			<td style="width:116px;">130149</td>
			<td style="width:163px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Calcium Chloride Anhydrous</td>
			<td style="width:175px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:116px;">C614-500</td>
			<td style="width:163px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Carnitine hydrochloride</td>
			<td style="width:175px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:116px;">C9500</td>
			<td style="width:163px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Collagenase type 2</td>
			<td style="width:175px;">Worthington Biochemical Corporation</td>
			<td style="width:116px;">LS004176</td>
			<td style="width:163px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Creatine</td>
			<td style="width:175px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:116px;">C0780</td>
			<td style="width:163px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Dexamethasone</td>
			<td style="width:175px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:116px;">D2915</td>
			<td style="width:163px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">DMEM/F12 (1:1; 1X)</td>
			<td style="width:175px;">Gibco</td>
			<td style="width:116px;">11330-032</td>
			<td style="width:163px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Dumont #7 - Fine Forceps</td>
			<td style="width:175px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:116px;">11274-20</td>
			<td style="width:163px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Epifluorescent micropscpe</td>
			<td style="width:175px;">Olympus X70</td>
			<td style="width:116px;">IX70</td>
			<td style="width:163px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Fetal Bovine Serum (Heat Inactivated)</td>
			<td style="width:175px;">Omega Scientific</td>
			<td style="width:116px;">FB-12</td>
			<td style="width:163px;">Lot# 206018</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Fine Scissors - Sharp</td>
			<td style="width:175px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:116px;">14060-09</td>
			<td style="width:163px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Graefe Forceps</td>
			<td style="width:175px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:116px;">11051-10</td>
			<td style="width:163px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Headband Magnifiers</td>
			<td style="width:175px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:116px;">28030-04</td>
			<td style="width:163px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Hemacytometer (Bright-Line)</td>
			<td style="width:175px;">Hausser Scientific</td>
			<td style="width:116px;">1475</td>
			<td style="width:163px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">HEPES (1M)</td>
			<td style="width:175px;">Gibco</td>
			<td style="width:116px;">15630-080</td>
			<td style="width:163px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Inosine</td>
			<td style="width:175px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:116px;">I4125</td>
			<td style="width:163px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Insulin-Transferrin-Selenium-X</td>
			<td style="width:175px;">Gibco</td>
			<td style="width:116px;">51500-056</td>
			<td style="width:163px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Isotemp 105 Water Bath</td>
			<td style="width:175px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:116px;">NC0858659</td>
			<td style="width:163px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Isotemp 3006</td>
			<td style="width:175px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:116px;">13-874-182</td>
			<td style="width:163px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Joklik Modified Minimum Essential Media</td>
			<td style="width:175px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:116px;">M-0518</td>
			<td style="width:163px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Laminin (Natural, Mouse)</td>
			<td style="width:175px;">Gibco</td>
			<td style="width:116px;">1795024</td>
			<td style="width:163px;">Lot# 1735572</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">L-Glutamine</td>
			<td style="width:175px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:116px;">G8540</td>
			<td style="width:163px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Masterflex C/L Single-Channel Variable-Speed Compact Pump</td>
			<td style="width:175px;">Cole-Palmer</td>
			<td style="width:116px;">EW-77122-24</td>
			<td style="width:163px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Minimum Essential Medium (MEM 1X)</td>
			<td style="width:175px;">Gibco</td>
			<td style="width:116px;">12350-039</td>
			<td style="width:163px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Molecular Biology Grade Water</td>
			<td style="width:175px;">Corning</td>
			<td style="width:116px;">46-000-CM</td>
			<td style="width:163px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Pen Strep Glutamine (100X)</td>
			<td style="width:175px;">Gibco</td>
			<td style="width:116px;">10378-016</td>
			<td style="width:163px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Spring Scissors - 6mm Cutting Edge</td>
			<td style="width:175px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:116px;">15020-15</td>
			<td style="width:163px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Taurine</td>
			<td style="width:175px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:116px;">T-8691</td>
			<td style="width:163px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

simultaneous isolation and culture of atrial myocytes, ventricular myocytes, and non-myocytes from an adult mouse heart

הבידוד והפולחן של מיוציטים לבביים מעכברים היו חיוניים לקידום ההבנה של פיזיולוגיה לבבית ופתופיזיולוגיה. בעוד בידוד מיוציטים מלבבות עכבר יילודים הוא פשוט יחסית, מיוציטים מהלב המורין הבוגר הם המועדפים. הסיבה לכך היא כי בהשוואה לתאי יילודים, מיוציטים בוגרים מדויק יותר recapitulate תפקוד התא כפי שהוא מתרחש בלב הבוגר vivo. עם זאת, מבחינה טכנית קשה לבודד מיוציטים לב עכבר בוגר בכמויות הדרושות ואת הכדאיות, אשר תורם למבוי סתום ניסיוני. יתר על כן, נהלים שפורסמו הם ספציפיים לבידוד של מיוציטים פרוזדוריים או חדריים על חשבון תאים פרוזדוריים חדריים שאינם מיוציטים. המתוארת כאן היא שיטה מפורטת לבידוד מיוציטים לבביים הן דרך האשורית והן החדרית, יחד עם מיוציטים לא-מיוציטים בין-מסלוליים חדריים, בו זמנית מלב עכבר יחיד. כמו כן מסופקים הפרטים עבור שיטות culturing תא ספציפי אופטימלי, אשר לשפר את הכדאיות של התא ותפקוד. פרוטוקול זה נועד לא רק לזרז את התהליך של בידוד תאי לב מורין למבוגרים, אלא גם כדי להגדיל את התשואה ואת הכדאיות של תאים לחקירות של תאי לב פרוזדוריים חדריים.

לב עכבר C57b6/j בן 10 שבועות מוביל בדרך כלל ל-75,000-150,000 מיוציטים א-טריים ו-1.0-1.5 x 106 מיוציטים חדריים, השווה לתשואה משוערת של 30%-50% עבור מיוציטים18,19. במהלך ומיד לאחר בידודים, מיוציטים לב קיימא צריך להופיע מוט בצורת ולא התכווצות. רוב מיוציטים לב מבודדים צריך להתאים את המורפולוגיה, המהווה אינדיקציה של זלוף יעיל. מורפולוגיה בצורת מוט יכולה גם להיות מנבא של הכדאיות. הפרוטוקול נועד לשפר את התשואה ואת הכדאיות של מיוציטים ולא מיוציטים מבודדים מלב עכבר חולה. יתר על כן, זה נבדק במודל של אי ספיקת לב הנגרמת על ידי עומס לחץ (נתונים לא מוצגים).
כדי לאשר בידוד הולם וניתן לשכפול של מיוציטים ולא מיוציטים מרקמת אבות ורקמות חדריות, התאים נצפו וצולמו בימים שונים בתרבות(איור 2). בנוסף, בוצעה תגובת שרשרת פולימראז כמותית של שעתוק הפוך (qRT-PCR) כדי למדוד את רמות התמלילים שהיו ספציפיים לסוג התא. טרופונין T שריר הלב(Tnnt2)הוא סמן של מיוציטים לבביים והתבטא בחוזקה הן בתרביות מיוציטים לבביות הן מבחינה משפטית והן בתרבויות מיוציטים לבביות חדריות(איור 3A). לעומת זאת, פפטיד נטריורטי פרך (Nppa, אשר מתבטא בדרך כלל אך ורק מיוציטים לב פרך למבוגרים בתנאים פיזיולוגיים) ושרשרת אור מיוסין 2 (Myl2, שהוא גן ספציפי myocyte חדרית) באו לידי ביטוי באופן חזק במיוחד בתרבויות מיוציטים לב מפרזדוריים חדריים, בהתאמה (איור 3B, C).
סמני פיברובלסט, פקטור שעתוק 21 (Tcf21), קולטן גורם גדילה שמקורו בטסיות הדם A (Pdgfra), ואשכול סמן תאים המופק ממונוציטט של התמיינות 68 (Cd68) באו לידי ביטוי אך ורק בתרבויות שאינן מיוציטים המבודדות הן מתאים פרוזדורים והן מחדרים חדריים (איור 3D-F). ההערכה היא כי שאינם מיוציטים להתפשר ~ 65% של כל תאי הלב וכי רוב אלה מקורם שושלת פיברובלסט או מונוציטים נגזר18,19,23,24. לפיכך, סמנים עבור שני שושלת אלה נבחרו להיות ייצוגיים, בהתחשב בהתעניינות באוכלוסיות הסלולר האלה במחקרים של מודלים ואטימולוגיות שונות של פתולוגיה לבבית.
חיסון של AMAMs ו- AMVMs עבור סמן t-tubule דיהידרופרידין (DHPR, שהוא ערוץ סידן תלוי מתח (L)-סוג) כמו גם קולטן ריאנודין (RYR2) הפגין t-tubules שלמים לאורך בידוד ותרבות לטווח ארוך (איור 4A,B). השפע של DHPR ולוקליזציה שהיה אופייני וייחודי למיוציטים אבריאליים חדריים הצביעו על נוכחותם של צינוריות. יתר על כן, קולוקליזציה של DHPR עם RYR2 immunostaining היה אינדיקטור של מבני דיאלאד שלמים. אימונוסטין עבור החלבון סרקומרי אלפא-actinin במיצ'יטים לב פרוזדוריים חדריים הביא דפוס פסים סרקומריים הצפוי. דפוס הפסים הסרקומי שימש להערכת הטוהר והכדאיות של מיוציטים לבביים מבודדים בשילוב עם צורה מורפולוגית בצורת מוט וכתמים גרעיניים עם TOPRO-3 (איור 4C,D; סגול ואדום). כצפוי, מיוציטים לבביים חדריים היו גדולים, והפגינו אורך ממוצע של ~ 150 מ"מ, ואילו מיוציטים לב פרך בממוצע ~ 75 מ"מ. יתר על כן, על ניתוח immunostaining, מיוציטים לב פרטלי (אבל לא מיוציטים לב חדריים) הציג ביטוי חזק של פפטיד נטריורטית פרזדורית (ANP) בתבנית מכתימה האופיינית לוקליזציה לרטיקולום אנדופלזמי וגרגרי הפרשה (איור 4C, D;ירוק).
מאפיין ייחודי מיוציטים לב אסטראלי הוא הסיווג שלה כתא אנדוקריני בנוסף לתא התכווצות. בעוד מיוציטים פרוזדורים מפרישים ANP בתנאים בסיסיים, הפרשת עולה בתגובה secretagogues (כלומר, אגוניסט אלפא-adrenergic, פנילפרין [PE]). יתר על כן, מיוציטים לב פרוזדורים להפריש ANP ושיתוף הפרשת לעבד חלק ההורמון ממצב מבשר שלה (Pro-ANP, 15 kD) לפפטיד המוצר (ANP 3kD)16,17. יכולת הפרשה זו ניתן לכמת באמצעות זיהוי immunoblot של ANP במדיה של מיוציטים לב אצטריים מבודדים בתגובה לטיפול PE חריפה (איור 4E). הפרשה זו ויכולת העיבוד של מיוציטים לב פנים נמצאה רגישה לתנאי culturing. לכן, זה הכרחי כי מדיום ציפוי מיוציטים פרסלי הוא בתוספת דקסמתזון, אינסולין, transferin, סלניום.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61224/61224fig1.jpg"> איור 1: סקירה סכמטית של זלוף לב מדרדר, עיכול ובידוד תאים. המוצגים הם השלבים העיקריים המעורבים בבידוד תאים הן מתאי האשכים והן מחדרי החדר בו זמנית מלב עכבר יחיד. (A) לב עכבר יחיד הוא משומר במהירות דרך העורקים העולה ו perfused באופן מדרדר. (B)הלב מופרד לרקמות פרוזדוריות חדריות להמשך עיכול והפרדה פיזית. (C) לאחר עיכול הולם, התאים מופרדים באמצעות סינון הכבידה לתוך סך של ארבעה שברים תאיים כי הם תרבותיים לניסויים הבאים. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/61224/61224fig1large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61224/61224fig2.jpg"> איור 2: ניתוח מורפולוגי של מיוציטים לבביים מבודדים בחדרים ולא מיוציטים בתרבות. (A) מיוציטים בין-תאיים של עכבר בוגר מבודד (AMAMs),(B)עכבר בוגר שאינו מיוציטים (AMANMs), (C) מיוציטים חדריים של עכבר בוגר (AMVMs), או (D) ) עכבר בוגר שאינו מיוציטים (AMVNMs) היו מצופים ב 5 x 105 תאים / תא על ארבעה תאים (1.7 ס"מ 2 ) שקופיותזכוכיתבמדיה מצופה בהתאמה. תמונות שלב התקבלו בימים המצוינים בתרבות באמצעות מטרה 10x תחת מיקרוסקופ epifluorescence. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/61224/61224fig2large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61224/61224fig3.jpg"> איור 3: ניתוח qRT-PCR מייצג של תרביות תאים מבודדות. RNA חולץ מיוציטים לב מבודדים טריים ולא מיוציטים, ורמות mRNA עבור סמני גנים ספציפיים לתאים נקבעו על ידי qRT-PCR4. (A) Tnnt2, טרופונין שריר הלב T (סמן מיוציטים לב); (B) Nppa, פפטיד נטריורטי מטריורי (סמן מיוציטים מטריאלי); (C) Myl2, שרשרת אור מיוסין 2 (סמן מיוציטים חדרי); (D) Tcf21, פקטור שעתוק 21 (סמן פיברובלסט); (E) Pdgfra, קולטן גורם גדילה נגזר טסיות הדם A (סמן פיברובלסט); (F) Cd68, אשכול של בידול 68 (סמן תא נגזר מונוציט). הנתונים מייצגים ממוצע ± SEM (*p ≤ 0.05 שונה מכל הערכים האחרים, כפי שנקבע על ידי ANOVA ואחריו הניתוח שלאחר הוק של ניומן קאול). <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/61224/61224fig3large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61224/61224fig4.jpg"> איור 4: ניתוח מורפולוגי ופונקציונלי מייצג של מיוקטי לב פרוזדוריים חדריים מבודדים. (A)AMAMs או (B) AMVMs היו מצופים ב 5 x 105 תאים / תא על ארבעה תאים (1.7 ס"מ2)שקופיות זכוכית במדיית ציפוי בהתאמה במשך 1 שעות כדי לאפשר הידבקות. זה היה ואחריו גם הזנה מחדש של מדיה ציפוי מיוציטים פרך או שינוי מיוציטים חדרית שמירה על מדיה בתוספת blebbistatin עבור 16 שעות נוספות. תרבויות תוקנו לאחר מכן אז immunostained עבור RYR2 (סגול), DHPR (ירוק), וכתם גרעיני TOPRO-3 (אדום). (C)AMAMs או (D) AMVMs היו מבודדים מצופים, לאחר מכן immunostained עבור a-actinin (סגול), ANP (ירוק), ו TOPRO-3 (אדום). מוצגות שתי תמונות מייצגות עבור כל סוג תא. (E)AMAMs היו מצופים ב 5 x 105 תאים / גם על צלחת תרבות 12 גם עבור 16 שעות במדיה ציפוי מיוציטים atrial. AMAMs טופלו לאחר מכן עבור 0.5 שעות עם הרכב או secretagogue ANP (פנילפרין, 50 מ"מ) לפני המדיה נאספו ונתון לניתוח immunoblot עבור ANP. לפני ניתוח immunoblot, דגימות מדיה היו צנטריפוגה ב 500 x g במשך 5 דקות כדי להסיר פסולת הסלולר ולהבטיח כי ANP שנצפה היה תוצאה של הפרשה פעילה של AMAMs. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/61224/61224fig4large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Simultaneous Isolation and Culture of Atrial Myocytes, Ventricular Myocytes, and Non-Myocytes from an Adult Mouse Heart at JoVE.com

Simultaneous Isolation and Culture of Atrial Myocytes, Ventricular Myocytes, and Non-Myocytes from an Adult Mouse Heart

שיטה מתוארת לבידוד בו זמנית של מיוציטים ולא מיוציטים הן מהאטיה והן מחדרי הלב של עכבר בוגר יחיד. פרוטוקול זה מביא לתשואות עקביות של מיוציטים לבביים ברי קיימא מאוד ולא מיוציטים ומפרט תנאי תרבות אופטימליים ספציפיים לתאים עבור פנוטיפים וניתוח במבחנה.

בידוד ותרבות בו זמנית של מיוציטים פרך, מיוציטים חדריים, ולא מיוציטים מלב עכבר בוגר

The isolation and culturing of cardiac myocytes from mice has been essential for furthering the understanding of cardiac physiology and pathophysiology. ...

simultaneous-isolation-culture-atrial-myocytes-ventricular-myocytes

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

7.2K Views.  San Diego State University. שיטה מתוארת לבידוד בו זמנית של מיוציטים ולא מיוציטים הן מהאטיה והן מחדרי הלב של עכבר בוגר יחיד. פרוטוקול זה מביא לתשואות עקביות של מיוציטים לבביים ברי קיימא מאוד ולא מיוציטים ומפרט תנאי תרבות אופטימליים ספציפיים לתאים עבור פנוטיפים וניתוח במבחנה.

Video: Simultaneous Isolation and Culture of Atrial Myocytes, Ventricular Myocytes, and Non-Myocytes from an Adult Mouse Heart

Primary Culture of Adult Rat Heart Myocytes

Cultured primary adult rodent heart cells are an important model system for cardiovascular research. Nevertheless, establishment of robust, viable cultured adult myocytes can be a technically challenging, rate-limiting step for many researchers. Here we described a protocol to obtain a high yield of adult rat heart myocytes that remain viable in culture for several days. The heart is isolated and perfused with collagenase and protease under low Ca2+ conditions to recover single myocytes. Ca2+-tolerant cells are obtained by stepwise increases in extracellular Ca2+ concentration in three subsequent wash steps. Cells are filtered, resuspended in culture medium, and plated on laminin coated slips. Cultured myocytes obtained using this protocol are viable for up to four days and are suitable for most experiments including electrophysiology, biochemistry, imaging and molecular biology.

In this paper, we described a typical way to isolate and culture adult rat heart myocytes. Collagenase and protease are used to digest and isolate single myocytes. Myocytes cultured follow this protocol meet most experiment requirements.

תרבות ראשונית של הלב Myocytes למבוגרים עכברוש

Cultured primary adult rodent heart cells are an important model system for cardiovascular research.  Nevertheless, establishment of robust, viable ...

Isolation and Genetic Manipulation of Adult Cardiac Myocytes for Confocal Imaging

Cardiac myocytes isolated from adult hearts are widely accepted as a model somewhere half way between embryonic and neonatal muscle cells on one side and a working heart on the other. Thus, cardiomyocytes serve as good models for cardiac cellular physiology and pathophysiology, for pharmaceutical investigations as well as for the exploration of transgenic animal models. Here we describe a method of isolating the cells from the heart. Furthermore we show how a genetic manipulation on cardiac myocytes can be performed without breeding a transgenic animal: This is the combination of long term culture (1 week) and adenoviral gene transfer. The latter one is described from the construction of the virus to the transduction of the cells. It can be used for the expression of genetically encoded biosensors (GEBs), fluorescent fusion proteins, but also for protein over expression and down regulation, e.g. using RNAi. Here we provide an example for the expression of a fusion protein staining a subcellular structure (Golgi). Such protein expression can be visualized by confocal imaging of z-stacks for a 3D-reconstruction of subcellular structures. The protocol comprises state-of-the-art in cell culture, molecular biology and biophysics and thus provides an approach for exploring new horizons in cellular cardiology.

Adult cardiac myocytes are primary cells that can be isolated from animal hearts and cultured for several days. Within this culture period adenoviral gene transfer can be used to express genetically encoded biosensors (GEBs) or fluorescent fusion proteins. Both approaches allow cellular investigations by means of confocal microscopy.

בידוד מניפולציה גנטית של Myocytes לב למבוגרים הדמיה confocal

Cardiac myocytes isolated from adult hearts are widely accepted as a model somewhere half way between embryonic and neonatal muscle cells on one side and ...

Isolation and Kv Channel Recordings in Murine Atrial and Ventricular Cardiomyocytes

KCNE genes encode for a small family of Kv channel ancillary subunits that form heteromeric complexes with Kv channel alpha subunits to modify their functional properties. Mutations in KCNE genes have been found in patients with cardiac arrhythmias such as the long QT syndrome and/or atrial fibrillation. However, the precise molecular pathophysiology that leads to these diseases remains elusive. In previous studies the electrophysiological properties of the disease causing mutations in these genes have mostly been studied in heterologous expression systems and we cannot be sure if the reported effects can directly be translated into native cardiomyocytes. In our laboratory we therefore use a different approach. We directly study the effects of KCNE gene deletion in isolated cardiomyocytes from knockout mice by cellular electrophysiology - a unique technique that we describe in this issue of the Journal of Visualized Experiments. The hearts from genetically engineered KCNE mice are rapidly excised and mounted onto a Langendorff apparatus by aortic cannulation. Free Ca2+ in the myocardium is bound by EGTA, and dissociation of cardiac myocytes is then achieved by retrograde perfusion of the coronary arteries with a specialized low Ca2+ buffer containing collagenase. Atria, free right ventricular wall and the left ventricle can then be separated by microsurgical techniques. Calcium is then slowly added back to isolated cardiomyocytes in a multiple step comprising washing procedure. Atrial and ventricular cardiomyocytes of healthy appearance with no spontaneous contractions are then immediately subjected to electrophysiological analyses by patch clamp technique or other biochemical analyses within the first 6 hours following isolation.

Kv channel dysfunction is associated with cardiac arrhythmias. In order to study the molecular mechanisms that lead to such arrhythmias we utilize a systematic protocol for isolation of atrial and ventricular cardiomyocytes from Kv channel ancillary subunit knockout mice. Isolated cardiomyocytes can then immediately be used for cellular electrophysiological studies, biochemical or immunofluorescence (IF) assays.

בידוד והקלטות בערוץ KV בcardiomyocytes פרוזדורים וחדרית Murine

KCNE genes encode for a small family of Kv channel ancillary subunits that form heteromeric complexes with Kv channel alpha subunits to modify their ...

Isolation of Human Atrial Myocytes for Simultaneous Measurements of Ca2+ Transients and Membrane Currents

The study of electrophysiological properties of cardiac ion channels with the patch-clamp technique and the exploration of cardiac cellular Ca2+ handling abnormalities requires isolated cardiomyocytes. In addition, the possibility to investigate myocytes from patients using these techniques is an invaluable requirement to elucidate the molecular basis of cardiac diseases such as atrial fibrillation (AF).1 Here we describe a method for isolation of human atrial myocytes which are suitable for both patch-clamp studies and simultaneous measurements of intracellular Ca2+ concentrations. First, right atrial appendages obtained from patients undergoing open heart surgery are chopped into small tissue chunks ("chunk method") and washed in Ca2+-free solution. Then the tissue chunks are digested in collagenase and protease containing solutions with 20 &mu;M Ca2+. Thereafter, the isolated myocytes are harvested by filtration and centrifugation of the tissue suspension. Finally, the Ca2+ concentration in the cell storage solution is adjusted stepwise to 0.2 mM. We briefly discuss the meaning of Ca2+ and Ca2+ buffering during the isolation process and also provide representative recordings of action potentials and membrane currents, both together with simultaneous Ca2+ transient measurements, performed in these isolated myocytes.

Isolation of Human Atrial Myocytes for Simultaneous Measurements of Ca2+ Transients and Membrane Currents

We describe the isolation of human atrial myocytes which can be used for intracellular Ca2+ measurements in combination with electrophysiological patch-clamp studies.

בידוד של myocytes פרוזדורי אדם למדידות בו זמנית של Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; ארעי וזרמים הממברנה

The study of  electrophysiological properties of cardiac ion channels with the patch-clamp  technique and the exploration of cardiac cellular Ca2+ ...

Isolation, Culture, and Functional Characterization of Adult Mouse Cardiomyoctyes

The use of primary cardiomyocytes (CMs) in culture has provided a powerful complement to murine models of heart disease in advancing our understanding of heart disease. In particular, the ability to study ion homeostasis, ion channel function, cellular excitability and excitation-contraction coupling and their alterations in diseased conditions and by disease-causing mutations have led to significant insights into cardiac diseases. Furthermore, the lack of an adequate immortalized cell line to mimic adult CMs, and the limitations of neonatal CMs (which lack many of the structural and functional biomechanics characteristic of adult CMs) in culture have hampered our understanding of the complex interplay between signaling pathways, ion channels and contractile properties in the adult heart strengthening the importance of studying adult isolated cardiomyocytes. Here, we present methods for the isolation, culture, manipulation of gene expression by adenoviral-expressed proteins, and subsequent functional analysis of cardiomyocytes from the adult mouse. The use of these techniques will help to develop mechanistic insight into signaling pathways that regulate cellular excitability, Ca2+ dynamics and contractility and provide a much more physiologically relevant characterization of cardiovascular disease.

Here we describe the isolation of adult mouse cardiomyoctyes using a Langendorff perfusion system. The resulting cells are Ca2+-tolerant, electrically quiescent and can be cultured and transfected with adeno- or lentiviruses to manipulate gene expression. Their functionality can also be analyzed using the MMSYS system and patch clamp techniques.

בידוד, תרבות ואפיון פונקציונלי של Cardiomyoctyes מאוס למבוגרים

The use of primary cardiomyocytes (CMs) in culture has provided a powerful complement to murine models of heart disease in advancing our understanding of ...

Isolation of Embryonic Ventricular Endothelial Cells

Cell culture has greatly enhanced our ability to assess individual populations of cells under myriad culture conditions. While immortalized cell lines offer significant advantages for their ease of use, these cell lines are unavailable for all potential cell types. By isolating primary cells from a specific region of interest, particularly from a transgenic mouse, more nuanced studies can be performed. The basic technique involves dissecting the organ or partial organ of interest (e.g. the heart or a specific region of the heart) and dissociating the organ to single cells. These cells are then incubated with magnetic beads conjugated to an antibody that recognizes the cell type of interest. The cells of interest can then be isolated with the use of a magnet, with a short trypsin incubation dissociating the cells from the beads. These isolated cells can then be cultured and analyzed as desired. This technique was originally designed for adult mouse organs but can be easily scaled down for use with embryonic organs, as demonstrated herein. Because our interest is in the developing coronary vasculature, we wanted to study this population of cells during specific embryonic stages. Thus, the original protocol had to be modified to be compatible with the small size of the embryonic ventricles and the low potential yield of endothelial cells at these developmental stages. Utilizing this scaled-down approach, we have assessed coronary plexus remodeling in transgenic embryonic ventricular endothelial cells.

Primary cell culture is a useful technique for analyzing specific populations of cells, particularly from transgenic mouse embryos at specific developmental stages. Herein, embryonic ventricles are dissected and dissociated, and antibody-conjugated beads recognize and separate out the endothelial cells for further analysis.

בידוד של תאי האנדותל חדרית עובריים

Cell culture has greatly enhanced our ability to assess individual populations of cells under myriad culture conditions. While immortalized cell lines ...

Isolation and Culture of Dental Epithelial Stem Cells from the Adult Mouse Incisor

Understanding the cellular and molecular mechanisms that underlie tooth regeneration and renewal has become a topic of great interest1-4, and the mouse incisor provides a model for these processes. This remarkable organ grows continuously throughout the animal&#39;s life and generates all the necessary cell types from active pools of adult stem cells housed in the labial (toward the lip) and lingual (toward the tongue) cervical loop (CL) regions. Only the dental stem cells from the labial CL give rise to ameloblasts that generate enamel, the outer covering of teeth, on the labial surface. This asymmetric enamel formation allows abrasion at the incisor tip, and progenitors and stem cells in the proximal incisor ensure that the dental tissues are constantly replenished. The ability to isolate and grow these progenitor or stem cells in vitro allows their expansion and opens doors to numerous experiments not achievable in vivo, such as high throughput testing of potential stem cell regulatory factors. Here, we describe and demonstrate a reliable and consistent method to culture cells from the labial CL of the mouse incisor.

The continuously growing mouse incisor provides a model for studying renewal of dental tissues from dental epithelial stem cells (DESCs). A robust system for consistently and reliably obtaining these cells from the incisor and expanding them in vitro is reported here.

בידוד והתרבות של תאי גזע השיניים אפיתל ממבוגרי העכבר הארקטיק

Understanding the cellular and molecular mechanisms that underlie tooth regeneration and renewal has become a topic of great interest1-4, and the mouse ...

Isolation, Culture and Transduction of Adult Mouse Cardiomyocytes

Cultured cardiomyocytes can be used to study cardiomyocyte biology using techniques that are complementary to in vivo systems. For example, the purity and accessibility of in vitro culture enables fine control over biochemical analyses, live imaging, and electrophysiology. Long-term culture of cardiomyocytes offers access to additional experimental approaches that cannot be completed in short term cultures. For example, the in vitro investigation of dedifferentiation, cell cycle re-entry, and cell division has thus far largely been restricted to rat cardiomyocytes, which appear to be more robust in long-term culture. However, the availability of a rich toolset of transgenic mouse lines and well-developed disease models make mouse systems attractive for cardiac research. Although several reports exist of adult mouse cardiomyocyte isolation, few studies demonstrate their long-term culture. Presented here, is a step-by-step method for the isolation and long-term culture of adult mouse cardiomyocytes. First, retrograde Langendorff perfusion is used to efficiently digest the heart with proteases, followed by gravity sedimentation purification. After a period of dedifferentiation following isolation, the cells gradually attach to the culture and can be cultured for weeks. Adenovirus cell lysate is used to efficiently transduce the isolated cardiomyocytes. These methods provide a simple, yet powerful model system to study cardiac biology.

This protocol describes a step-by-step method for the reproducible isolation and long-term culture of adult mouse cardiomyocytes with high yield, purity, and viability.

בידוד, תרבות התמרה של cardiomyocytes עכבר למבוגרים

Cultured cardiomyocytes can be used to study cardiomyocyte biology using techniques that are complementary to in vivo systems. For example, the purity and ...

Methods for the Isolation, Culture, and Functional Characterization of Sinoatrial Node Myocytes from Adult Mice

Sinoatrial node myocytes (SAMs) act as the natural pacemakers of the heart, initiating each heart beat by generating spontaneous action potentials (APs). These pacemaker APs reflect the coordinated activity of numerous membrane currents and intracellular calcium cycling. However the precise mechanisms that drive spontaneous pacemaker activity in SAMs remain elusive. Acutely isolated SAMs are an essential preparation for experiments to dissect the molecular basis of cardiac pacemaking. However, the indistinct anatomy, complex microdissection, and finicky enzymatic digestion conditions have prevented widespread use of acutely isolated SAMs. In addition, methods were not available until recently to permit longer-term culture of SAMs for protein expression studies. Here we provide a step-by-step protocol and video demonstration for the isolation of SAMs from adult mice. A method is also demonstrated for maintaining adult mouse SAMs in vitro and for expression of exogenous proteins via adenoviral infection. Acutely isolated and cultured SAMs prepared via these methods are suitable for a variety of electrophysiological and imaging studies.

Methods are demonstrated for the isolation of sinoatrial node myocytes (SAMs) from adult mice for patch clamp electrophysiology or imaging studies. Isolated cells can be used directly or can be maintained in culture to permit expression of proteins of interest, such as genetically encoded reporters.

שיטות הבידוד, תרבות האפיון פונקציונלי של myocytes צומת Sinoatrial של עכברים בוגרים

Sinoatrial node myocytes (SAMs) act as the natural pacemakers of the heart, initiating each heart beat by generating spontaneous action potentials (APs). ...

Simultaneous Isolation of High Quality Cardiomyocytes, Endothelial Cells, and Fibroblasts from an Adult Rat Heart

The rat is an important animal model used in cardiovascular research, and rat cardiac cells are used routinely for in vitro analysis of the molecular mechanisms of cardiovascular disease progression such as cardiac hypertrophy, fibrosis, and atherosclerosis. Although several attempts with variable success have been made to develop immortalized cell lines from the cardiovascular system to understand these cellular mechanisms, primary cells offer a more natural and close to in vivo environment for such studies. Therefore, different laboratories working on a particular cell type have developed protocols to isolate individual types of rat cardiac cells of interest. A protocol that allows the isolation of more than one cell type, however, is missing. Here an optimized protocol is described that allows the isolation of high-quality major cardiac cell types (cardiomyocytes, endothelial cells, and fibroblasts) from a single preparation and enables their use for cellular analyses. This permits the most efficient use of available resources, which may save time and reduce research costs.

Several protocols have been developed and described for the isolation of different cardiac cell types from a rat heart. Here, an optimized protocol is described that allows the isolation of high-quality major cardiac cell types (cardiomyocytes, endothelial cells, and fibroblasts) from a single preparation, reducing the experimental costs.

בידוד סימולטני של Cardiomyocytes באיכות גבוהה, תאים אנדותל, ו Fibroblasts של לב עכברוש מבוגר

The rat is an important animal model used in cardiovascular research, and rat cardiac cells are used routinely for in vitro analysis of the molecular ...