פרוטוקול זה נועד לפשט את הכנת קלט נמוך, ספריות רצף RNA קטנות מעוברים מוקדמים כדי פרופיל מדויק microRNAs המסדירים התפתחות עוברית. היתרון של טכניקה זו הוא שהיא מונעת ארגון של דגימות קלט נמוך ו ניתן להחיל בקלות על תאים לא ממוינים וממוינים. אנו גם מדגימים היערכות עובר זהירה כדי למנוע גרסאות בין שכפולים.
שיטה זו יכולה להיות מיושמת על מחקרים זמניים, גנטיים והתפתחותיים או יישומים אחרים שבהם ריכוזי RNA קלט נמוכים. בעתיד, שיטה זו עשויה לשמש כדי לאבחן הפרעות התפתחותיות שבהן microRNAs הם dysregulated. החלק המאתגר ביותר מבחינה טכנית בפרוטוקול זה הוא ניתוח העובר.
מכיוון שיש לנתח כל עובר, שלב, תמונה ולאחר מכן נותק במהירות כדי להבטיח את כדאיות התא. כדי לנתח את העוברים, לשטוף את הרחם של עכבר נקבה בהריון עם PBS ולמקם אותו בצלחת פלסטיק סטרילי 10 ס"מ. השתמש מספריים microdissection להפריד את האזור המכיל decidua לקלף את שריר הרחם כדי לחשוף את כל decidua.
כדי לנתח את העוברים, לשטוף את הרחם של עכבר נקבה בהריון עם PBS ולמקם אותו בצלחת פלסטיק סטרילי 10 ס"מ. השתמש במספריים microdissection כדי להפריד את decidua המכיל אזור. להעביר את כל העוברים לתוך צלחת חדשה עם PBS נקי ולקחת תמונה של המלטה כולה.
לאחר מכן תדמיינו כל עובר בנפרד, וספורו את מספר ההגדלות, תוך שמירה על ההגדלה והחשיפה קבועה בין הניסויים. לעוברים מעל E8.0, ערפו את ראשם ממש מעל הפלג אוטי והעבירו את הראש לנקייה של צלחת של 48 בארות. מוסיפים 250 מיקרוליטרים של פפאין לבאגם ומורידים למעלה ולמטה בעדינות.
השתמש במיקרוסקופ כדי לבדוק גושים ולהמשיך צינורות למעלה ולמטה עד המתלה תא יחיד מושגת. לאחר מכן להוסיף 250 microliters של FBS לתאים ולסנן 500 microliters של ההשעיה באמצעות מסנן רשת ניילון 35 מיקרומטר. מעבירים את הסינון לצינור חדש של 1.5 מיליליטר ומסובבים אותו ב-200 x גרם לחמש דקות.
העבר את העל-טבעי לצינור חדש, ולחץ מחדש על גלולת התא ב-300 מיקרוליטרים של PBS עם BSA. כאשר מוכן למיין את התאים שוב דרך צינור כובע מסנן ולהוסיף DAPI כדי להכתים תאים חיים. השתמש ממיין תאים עם חריר 70 מיקרומטר כדי למיין כל מדגם לתוך 500 microliters של פתרון תיזה מיצוי RNA, ולאחר מכן לערבב ולאחסן את המדגם ב שלילי 80 מעלות צלזיוס.
הוסיפו חמישה מיקרוליטרים של צבע טעינה פי 6 לכל דגימה וערבבו לפי צינורות. טען את הדגימות על ג'ל פוליאקרילמיד 6%TBE החל מהבאר הראשונה והשאיר נתיב אחד בין כל דגימה. הפעל את הג'ל ב 150 וולט במשך 30 עד 40 דקות 0.5X TBE פועל חוצץ.
כאשר הג'ל סיים לרוץ, הסר אותו בזהירות מצלחות הזכוכית והצב אותו במגש מאריזתו המקורית, וכיוון. הסר את המאגר פועל להכתים את הג'ל במשך 15 דקות. ואז תדמיין את זה על מאיר טראנס UV.
זהה את הרצועה ב- 150 זוגות בסיסים ולהשתמש בסכין גילוח נקי כדי למלמל אותה. הקפד להימנע מהמוצר העמום של המתאם ב- 130 זוגות בסיסים. מכניסים את פרוסות הג'ל לצינורות מיקרוצנטריפוגה ומסובבים אותן במהירות המרבית למשך 30 שניות.
לאחר מכן, השתמשו בקצה P200 כדי למחוץ את פרוסת הג'ל לחתיכות הקטנות ביותר האפשריות ולהפיג את הקצה לתוך הצינור. מוסיפים 300 מיקרוליטרים של מאגר אלוטיון לכל צינור, שוטפים את חתיכות הג'ל מהצד. חבר מחדש את קצה פיפטה ולשטוף אותו לפני הסרתו מהצינור.
דגירה הדגימות לילה ב 25 מעלות צלזיוס עם 1,000 סל"ד רועד. ביום שלמחרת, לסובב אותם במהירות מקסימלית במשך 10 דקות ולהעביר את supernatant לצלחת RNase חינם 96-well. הוסיפו 50 מיקרוליטרים של גם גם גם לדגימה ופיגט כדי לערבב.
לאחר מכן מוסיפים 350 מיקרוליטרים של isopropanol, מערבבים את המדגם ודוגרים את הצלחת בטמפרטורת החדר במשך 10 דקות תוך כדי נדנדה. לאחר הדגירה, משוך את הצלחת ומגנט אותה לשתי דקות. השליכו את העל-טבעי ושטפו את חרוזים עם 950 מיקרוליטרים של 80% אתנול למשך 30 שניות.
יבש את המדגם במשך שלוש דקות, ולאחר מכן להסיר את כל הנוזלים שיורית בתחתית באר. מוציאים את הלוחית מהעמוד המגנטי. ולתלות מחדש את חרוזים ב13 microliters של מאגר ההתלות מחדש.
דגירה הצלחת במשך שתי דקות, ולאחר מכן להעביר אותו בחזרה לדוכן המגנטי במשך שלוש דקות. מעבירים 12 מיקרוליטרים של העל-טבעי לצינור נקי ומאחסנים אותו למשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס או לטווח ארוך ב-20 מעלות צלזיוס שליליות. עוברים ב E7.5, E8.5, ו E9.5 נקצרו.
ו somite מבוים כדי לפתור את מרווחי הזמן של שש שעות. כאשר נעשה שימוש בניתוח רכיבים עקרוניים כדי לקבץ דגימות בהתבסס על דמיון, נמצא כי דגימות מתקבצות לפי גיל. תאי סמל עצבי נודדים נודדים תויגו כי E8.5 עם Wnt1-Cre ו E9.5 עם Sox10-Cre.
השוואה בין שני נהגי CRE מאשרת כי הם מסמנים אוכלוסיות שונות בעוברים עכבר מוקדם. רנ"א כומת עם ספקטרופוטומטר ואלקטרופורזה נימית. בעוד עקבות הספקטרופוטומטר גילו כי ה- RNA אינו מכיל חלבונים מזהמים וריכוז תאים גבוה, הוא לא היה רגיש מספיק כדי לזהות שינויים בריכוז ה- RNA עם הגיל.
ניתן להשתמש בעקבות האלקטרופורזה נימי כדי להעריך את הריכוז והגודל של שברי ה- RNA. פסגות ב 2, 000 ו 5, 100 נוקלאוטידים הם 18S ו 28S ריבוזומלי RNA, בהתאמה. בעוד אזור ה-RNA הקטן ממוקם בכ-150 נוקלאוטידים.
ניתן להשתמש בחילוץ ג'ל כדי לבודד את ספריות רצף ה- RNA הקטנות הרחק ממדריכים של המתאם. לפני כריתה, מספר רב של גדלי מוצרים קיימים בכל מדגם. עקבות אלקטרופורזה נימי לפני ואחרי בחירת גודל להראות את השיפור בטוהר של 150 זוג בסיס הספרייה המוצר לאחר טיהור ג'ל.
עיצבנו פרוטוקול זה כדי לפצל הכנת RNA מדגימה אחת לספריות רצף RNA קטנות ולספריות רצף mRNA בצובר. זה יתייחס לשאלות סביב לא רק ביטוי microRNA, אלא גם אילו מטרות mRNA עשוי להיות מוסדר על ידי microRNAs לידי ביטוי. טכניקה זו אפשרה לנו לקבל תצוגה מקיפה של microRNAs המבוטאים ביותר ואת הרגולציה של המטרות שלהם בתאי סמל עצבי גולגולתי בין גסטרולציה וסגירת צינור עצבי.
