הפרוטוקול שלנו מאפשר זיהוי וניתוח מפורטים של מונוציטים ומאקרופגים ותאי T ותת-קבוצות הרלוונטיות שלהם בתוך הנוירונים והלוביום ורקמות שונות אחרות של המערכת החיסונית. הטכניקה שלנו מקלה על הקציר האמין של תאי החיסון בחיים מהסינוביום ורקמות רלוונטיות אחרות לאפיון מקיף של התגובה החיסונית האוסטיאו-ארטריטית. לבידוד של רקמות מעניינות מעכבר מודל דלקת מפרקים ניוונית, עם העכבר במצב עלוב, לנגב את החזה, הבטן והרגליים עם 70% אתנול.
השתמש מספריים כדי לפתוח בזהירות את העור לאורך קו האמצע של הבטן תוך השארת חלל הבטן שלם. ובעדינות למשוך את העור בצד ימין של החיה מן השריר הבסיסי, משאיר את רקמת השומן תת עורית מחובר לעור. מניחים את העכבר תחת מיקרוסקופ חיטוי ולהשתמש שני מדפים דקים מעוגלים בעדינות להקניט את רקמת השומן הממוקם בירך.
לאחר זיהוי שלושת כלי ההצלבה, השתמש במטלות ניתוח עדינות כדי להסיר את בלוטות הלימפה ההמומות הממוקמות בצומת של כלי הדם, דואג לא לקרוע את הקפסולה. השתמש במטחנים כדי להסיר את השומן הנותר מפני השטח של בלוטות הלימפה ולפתוח את חלל הבטן. אם לא ניתן לראות שומן שנותר, למקם את בלוטות הלימפה מיד מוכן בעבר שכותרתו שש צלחת גם מלא 0.5 מיליליטר של מדיה RPMI.
לאחר מכן, פתח את חלל הבטן. השתמש מספריים עדין כדי להוציא את הטחול בעדינות לחלץ את המעיים כדי לחשוף את aorta ואת bifurcation שלה. לאחר מכן, מניחים את הטחול מיד שהוכן בעבר ותויג שישה שיחק היטב מלא 0.5 מיליליטר של מדיה RPMI.
הסר את בלוטות הלימפה iliac הממוקם בחלק הטרמינל של בית הישעור הבטן ואת המקור של עורק איליאק נפוץ בזהירות להסיר את העור משני הגפיים האחוריות. מיד למקם את בלוטות הלימפה בצלחת מוכנה בעבר שכותרתו שש צלחת היטב לבנות עם 0.5 מיליליטר של מדיה RPMI איגינג כל בלוטות הלימפה משני בעלי חיים. באמצעות מספריים עדינים או אזמל לנקות את עצם הירך השמאלית של רקמת השריר המצורפת וניתק בזהירות הן את מחניקה ואת מפרק הירך, משאיר את העצם כולה שלם תוך הסרת עצם הירך.
לאחר מכן הניח את עצם הירך בצלחת מוכנה בעבר ותייג שש צלחת היטב מלא 0.5 מיליליטר של מדיה RPMI. זהה את גיד הפטה של מפרק החנק הימני ולהשתמש מספריים עדינים כדי להסיר את רקמת השריר הסמוכה proximal למפרק עד כחמישה מיליליטר של גיד quadriceps proximal כדי patella נחשפים. חותכים דרך גיד הארבע ראשי כשלושה עד ארבעה מילימטרים קרובים לפטלה כדי ליצור ידית ולהשתמש במלקבעים עדינים כדי למשוך בעדינות את המתח מהמפרק כדי לחשוף את הקצוות של הקובץ המצורף לכמוסה המשותפת.
החל מעצם הירך ותנועה לכיוון השוקה, השתמש באזמל כדי לחתוך בזהירות לאורך הקצוות של כמוסה משותפת משני הצדדים תוך שמירה על מתיחה עדינה על גיד quadriceps. כאשר בלוק הרקמה הסינוביאלית מחובר רק השוקה, כרית השומן תוך-רחמי צריך להיות גלוי בבירור דיסטלי patella והוא יכול להיות מנותק בעדינות מן ההיבט המפרקי והקודם של מינסקי. לאחר מכן, לחתוך לאורך החלק הנותר של כמוסה משותפת כדי להסיר את בלוק רקמת סינוביאלי מיד למקם אותו מוכן בעבר שכותרתו שש צלחת גם מלא 1.5 מיליליטר של מדיה RPMI.
כאשר כל הרקמות נאספו, למקם שני טחול מאגר לכל תנאי על מסננת תא 70 מיקרומטר בצינור 15 מיליליטר ולהשתמש בוכנה סטרילית שלושה מיליליטר מזרק כדי קצב המוני בעדינות את הרקמות דרך מסנן רשת שטיפה מסננת לעתים קרובות עם סך של שישה מיליליטר של RPMI 1640 בינוני בתוספת 10% FBS. להרוס את התאים על ידי צנטריפוגה, ולהשעות מחדש את גלולה בחמישה מיליליטר של פחזנית תמוגה תא דם אדום. לאחר חמש דקות, לעצור את התגובה עם 10 מיליליטר של PBS ו צנטריפוגה התאים.
כאשר לא יותר כדוריות דם אדומות נצפו, להשעות מחדש את גלולה במיליליטר אחד של PBS טרי לספירה. עבור עיבוד בלוטות הלימפה מקום כל ארבעת בלוטות הלימפה על מסננת תא 70 מיקרומטר בצינור חדש 15 מיליליטר ולהשתמש בוכנה סטרילית חדשה שלושה מיליליטר כדי להקניט בעדינות את בלוטות הלימפה דרך רשת לתוך מתלה תא יחיד, ואז צנטריפוגה התאים ב 500 פעמים G במשך חמש דקות, להשליך את supernatant ולהשעות מחדש את גלולה ב 500 microliters כדי לבודד את מח העצם, השתמש במלקחיים אגודל רקמה כדי לתפוס בזהירות את עצם הירך שלם ולהשתמש מספריים חדים כדי לחתוך את הקצה של עצם הירך proximal.
הכנס מחט 23 מד לתוך אמצע הרץ intercondylar של עצם הירך ולסובב את המחט תוך הפעלת לחץ עדין לקדוח חור לתוך הרץ. שינוי המחט לפי הצורך, לשטוף את תכולת העצם עם שישה מיליליטר של RPMI בתוספת 10% FBS על מסננת תא 70 מיקרומטר על צינור חדש 15 מיליליטר ולהשתמש בוכנה חדשה שלושה מיליליטר מזרק ללחוץ בעדינות את מח העצם דרך רשת. להלן, לבצע את הצעד RBC כפי שהוכח עבור הטחול.
כאשר לא יותר כדוריות דם אדומות נצפו, להשעות מחדש את גלולה במיליליטר אחד של PBS טרי לספירה. לעיבוד רקמת הסינוביאלית השתמש במספריים כירורגיים עדין כדי לקוביות את שני בלוקי רקמת הסינוביאלית לחתיכות זעירות ולהעביר את הדגימות לצינור חדש של 15 מיליליטר. לשטוף את מיכל האיסוף עם 500 microliters של מדיום כדי לאסוף את כל התאים הנותרים ורקמות סינוביאלי ולמשוך את הכביסה בצינור איסוף מדגם.
לאחר מכן, להוסיף נפח מספיק של אנזים כדי להשיג ביחידה אחת לכל ריכוז סופי מיליליטר ולעכל את דגימת רקמת הסינוביאלית ב 37 מעלות צלזיוס באינקובטור במשך שעתיים של מסובב. להבטיח תנועה מספקת בעת הצבת הצינורות במסובב. בסוף הדגירה, לעצור את העיכול עם שמונה מיליליטר של RPMI בתוספת 10% FBS ולסנן את ההשעיה התא דרך מסננת תא 70 מיקרומטר לתוך צינור חדש 15 מיליליטר.
לשטוף את הצינור הישן 15 מיליליטר עם חמישה מיליליטר של מדיום ולהשתמש בזה כדי לשטוף את המסנן. לאחר מכן, להרוס את התאים על ידי צנטריפוגה לשימוש חוזר את גלולה ב 500 microliters של PBS לספירה. כדי לבצע כתמי כדאיות של תאי החיסון המבודדים, הוסיפו חמש פעמים 10 לחמשת התאים של כל מתלה תא ל הבאר המתאימה של שתי צלחות שונות של 96 בארות U-bottom ואספו את התאים לתחתית כל באר.
כלול תמיד מספיק תאים לא מזוהמים של כל סוג רקמה כפקדים שליליים. לשטוף תאים עם 200 microliters של PBS ולהשעות מחדש את כדורי 100 microliters של תאים בצבע תגובתי אמין מחלחל ל הבאר עבור דגירה 15 דקות בארבע מעלות צלזיוס מוגן מפני אור. בסוף הדגירה לשטוף את התאים פעמיים 200 microliters של חיץ FACS לכל לשטוף מחדש להשעות כל גלולה ב 100 microliters של הנוגדן המתאים של עניין או קוקטייל שליטה.
אם גם הכתמים החוץ-תאיים וגם הכתמים החוץ-תאיים מתבצעים באותו שלב ביצוע של הכתמים החוץ-תאיים כעת. לאחר דגירה של 30 דקות בארבע מעלות צלזיוס המוגן מפני שטיפה קלה של התאים פעמיים עם 200 מיקרוליטרים של מאגר FACS ל הבאר ולהשעות מחדש את התאים ואת צלחת לוח תת-קבוצה מונוציטים ב 250 microliters של חיץ FACS בתוספת EDTA מילימולרי אחד. לבצע שלב זה רק אם לא מתוכנן כתמים תאיים, אחרת לעבור להיבט הכתמים תאיים של הפרוטוקול.
לאחר מכן, העבר כל דגימת תת-קבוצה של מונוציטים לצינור FACS המתאים המתאים על קרח המוגן מפני אור. עבור כתמים בין תאיים של תאי לוח תת-קבוצה של תאי T, השהה מחדש את כדורי ב-200 מיקרוליטרים של מאגר קיבעון מערכת קיבעון וסלמיביליזציה מתאימה עבור דגירה של 40 דקות בארבע מעלות צלזיוס המוגנות מפני אור. בסוף הדגירה לשטוף את התאים פעמיים עם 200 microliters של חיץ שטיפת permeabilization ולהשעות מחדש את כדורי 100 microliters של הנוגדן המתאים של עניין או קוקטייל שליטה עבור דגירה 40 דקות בארבע מעלות צלזיוס מוגן מפני אור.
לאחר מכן, לשטוף את התאים פעמיים ב 200 microliters של חיץ שטיפת permeabilization לכל לשטוף. ולהשעות מחדש את התאים ב 250 microliters של FACS בתוספת מאגר EDTA לפני העברת הדגימות לתוך צינורות FACS המתאימים על קרח מוגן מפני אור. כאן, ניתן לראות את אסטרטגיית הגתה ההיררכית של תת-הקבוצה המונוצטית על תאים חיסוניים שנאספו ממח העצם של בעלי חיים שטופלו ב- DMM.
טרולים לא מזוהמים יכולים לשמש כדי לקבוע את התשלילים האמיתיים לכתם המתים בחיים ואת השערים ניתן להתאים בכל פעם הניסוי נערך לפי הצורך. בניתוח מייצג זה, תאי החיסון היו מבודדים מרקמות הסינוביאליות ומוכתמים בסמני משטח חוץ-תאיים, שישה שבועות לאחר ניתוח שליטה ב- DMM או מזויפים. אחוז גבוה יותר של Ly-SC חיובי MHC2 שלילי M2 מקרופאגים נצפו בבעלי חיים שטופלו DMM בהשוואה לאוכלוסיות התא שנצפו בעכברים ניתוח מזויפים.
כאן, ניתן לראות את אסטרטגיית הגתה ההיררכית עבור לוח תאי T הנוסף והמעקבי על תאי החיסון המבודדים מטחולם של בעלי חיים שטופלו ב- DMM. אחוז גבוה יותר של תאי TH1 נצפו בבלוטות הלימפה ורקמות סינוביאליות של בעלי חיים DMM, כמו גם מספרים גבוהים יותר של תאים רגולטוריים T ותאי TH17. כדי להבטיח רכישה של דגימות באיכות גבוהה, יש לקצור את הרקמות בצורה מהירה, קפדנית ועקבית.
לאחר תאי החיסון בודדו, ניתוח במורד הזרם יכול להתבצע כגון RTPCR, תרבות התא לנוח על הדם כדי להאיר אור על תהליכים מולקולריים של עניין.
