פרוטוקול זה מאפשר להעריך שינויים מורפולוגיים פוטנציאליים בנוירונים ובעמודי שדרה דנדריטיים שעשויים לה מדגישים חריגות נוירוכימיות והתנהגותיות. זה ייחודי ושימושי עבור לדמיין נוירונים באזורים שונים במוח בחולדות, אשר בשילוב עם תוכנת שחזור מתוחכמת מאפשר לחוקרים להבהיר את המנגנונים האפשריים שבבסיס תפקוד נוירוקוגניטיבי. התחילו בהכנת פתרון PVP בהתאם לכיווני כתב היד.
מלאו את הצינור ב-PVP והשאירו אותו למשך 20 דקות. ולגרש אותו דרך הקצה השני עם מזרק 10 מיליליטר. שלבו 170 מיליגרם של גם גם 250 מיקרוליטרים של מתילן כלוריד.
ואז ביסודיות מערבולת ההשעיה. לאחר מכן, מוסיפים 6 מיליגרם של צבע DilC18(3) ליפופילי ל-300 מיקרוליטרים של מתילן כלוריד ומערבולת. Pipet 250 מיקרוליטרים של מתלי חרוז טונגסטן על מגלשת זכוכית.
המתינו עד שההשעיה תיייבש באוויר ותוסיפו 300 מיקרוליטרים של תותר הצבע. לאחר התייבשות, להשתמש סכין גילוח כדי לפצל את התערובת לשני צינורות צנטריפוגה 1.5 מיליליטר ולמלא את הצינורות במים. sonicate את התערובת באמבט מים עד הומוגני.
מוודא כי קצה sonicator טמון ישירות על הצינורות. מערבבים את שתי תערובות בצינור חרוט 15 מיליליטר. ו sonicate במשך שלוש דקות נוספות, לוודא כי לא גושים גדולים של חרוזים מצופים צבע להישאר.
לאחר sonication, לצייר את התערובת לתוך צינורות מצופה PVP עם מזרק 10 מיליליטר. ולהאכיל את הצינורות לתחנת ההכנה. סובב את הצינור למשך דקה אחת.
בזהירות להסיר את כל המים באמצעות מזרק. מפעילים את גז החנקן ומתאימים את זרימת החנקן לכ-0.5 ליטר לדקה. לסובב את הצינור בתחנת ההכנה ולייבש אותו עם חנקן במשך 30 דקות.
מוציאים את הצינור מהתחנה וחותכים אותו למקטעים של 13 מ"מ עם חותך צינורות. ודא כי החולדה אינה מגיבה לגירויים מזיקים ורפלקסים נעדרים. אז תאבטח את זה בתמקם ה"סופין".
בצע חתך לאורך קו האמצע של בית החזה. מפרידים את הסרעפת ופתיחת החזה במספריים. ואז להכניס מחט 20 מד 25 מילימטר לתוך החדר השמאלי.
מיד לחתוך את ה אטריום הנכון עם מספריים וללעוס 15 מיליליטר של 100 מילימטר PBS עם קצב זרימה של 5 מילימטרים לדקה. לאחר מכן לבלבל 100 מיליליטר של 4%PFA במאגר PBS. לאחר תדלוק, להסיר את המוח החולדה כולה.
ולהדביק אותו עם 4%PFA במשך 10 דקות. השתמש במטריצת מוח עכברוש לחתוך 500 מיקרומטר עבה קטע coronal. לעשות חתך אגרוף ולשמור את הלהב במקום.
לאחר מכן בצע חתך שני עם להב שני ולהסיר אנכית את הלהב הראשון, שמירה על הרקמה על פני הלהב. מניחים את פרוסות המוח בצלחת 24 באר עם 1 מיליליטר של PBS בכל באר. ולחזור על התהליך עד שכל הפרוסות נחתכו.
הסר PBS מכל באר ממוקדת. טען את הסחוס עם חתיכת צינורות דיל / טונגסטן והכנס אותו למוליך. שים פיסת נייר סינון בין שני מסכי רשת שינוי.
ולחבר את המוליך לצינור ההליום. ואז להתאים את לחץ הפלט של הליום ל 90 פאונד לאינץ 'מרובע. הנח את המוליך אנכית במרכז הבאר הממוקדת באורך 1.5 ס"מ בין המדגם למסך רשת שינוי.
ואז לירות צינורות דיל / טונגסטן. לטעון את הסחוס עם הצינור הבא ברציפות לירות את חרוזים מן הצינורות על הפרוסות הנותרות. מלאו את צלחת ה-24 בארות ב-100 מילימולרים PBS.
ולשטוף את הפרוסות שלוש פעמים עם 500 microliters של PBS טרי. ודא כי הפרוסות לא להתהפך במהלך לשטוף. בסיום, הוסיפו 500 מיקרוליטר של PBS טרי לפרוסות.
ותגרה אותם במשך שלוש שעות בארבע מעלות צלזיוס בחושך. לאחר הדגירה, השתמש במברשת דקה כדי להעביר את פרוסות המוח לשקופיות זכוכית. ומיד להוסיף מיליליטר אחד של מדיום הרכבה antifade לכל קטע.
מניחים כיסוי של 22 על 15 מילימטר מעל החלקים ומייבשים את השקופיות בחושך. הפעל את מערכת המיקרוסקופ הקונפוקל ולעבור למטרה 60X. התאם את הגדרות ההדמיה בהתאם לכיווני כתב היד.
ולקבל תמונות Z-stack עבור סוג נוירון ממוקד מבוסס על גבולות אזור המוח ומאפיינים מורפולוגיים של נוירונים. לבודד את הנוירון קליפת המוח העיקרי מחולדות F344/N ביום שלאחר הלידה אחד ולתרבת אותם בצלחת תחתונה זכוכית 35 מילימטר במשך שבוע אחד. מחצית מהמדיום מרענן ביום השלישי לאחר הבידוד.
לשטוף את המנה פעמיים עם 1 מיליליטר של 100 מילימולר PBS. ולתקן את התאים עם 4% PFA במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. תייג את התאים בצורה בליסטית כפי שתואר קודם לכן.
ולשטוף אותם שלוש פעמים נוספות עם 1 מיליליטר של PBS. מוסיפים 500 מיקרוליטרים של PBS לתאים ו דגירה אותם במשך שלוש שעות בארבע מעלות צלזיוס בחושך. לאחר מכן הוסיפו 200 מיקרוליטרים של מדיום הרכבה נגד חיטוי.
ולקבל תמונות מחסנית Z עבור כל נוירון ממוקד. נוירונים פירמידליים טיפוסיים באזור ההיפוקמפוס בחלקי המוח של החולדות זוהו עם טכנולוגיית תיוג בליסטי המאופיינת בדנדריט אפית אחד גדול וכמה דנדריטים בסיסיים קטנים יותר סביב סומה. תוכנת ניתוח כמותי שחזור עצבי שימשה להתחקות אחר ענפים דנדריטיים ולזהות קוצים.
לאחר מכן, התוכנה שימשה להערכת מורכבות הסתעפות דנדריטית ומורכבות ארבור עצבית. שינויים מורפולוגיים בקוצים דנדריטיים הוערכו באמצעות אורך, נפח וקוטר ראש. ואז קוצים סווגו לקוצים דקים, דקים ופטריות.
והתדירות היחסית של מספר הקוצים בין כל רדיוס נבדקה. יתר על כן, טכניקת התיוג הבליסטי אומתה על נוירון פירמידלי ראשוני בתרבות התאים. נוירונים פירמידליים זוהו בהתבסס על צורת המשולש של הומה ודנדריט אפי גדול.
לאחר מכן נעשה שימוש בתוכנת שחזור עצבי כדי לנתח את התפלגותם של קוצים דנדריטיים דקים ואורך עמוד שדרה דנדריטי. בעת ניסיון פרוטוקול זה, חשוב להימנע גושים גדולים או אשכולות של חרוזים טונגסטן מצופה צבע בליסטי החל הכנה. גושים לא יאפשרו לנוירונים בודדים להיות מכובדים.
בשילוב עם תוכנת שחזור עצבי שיטה זו מאפשרת לנו לבחון מורפולוגיה של עמוד השדרה העצבי והדנדריטי בנוירונים פירמידליים בהיפוקמפוס. תוכנת שחזור עצבי להשתמש באלגוריתם להציע סיווג בסיוע אוטומטי של קוצים דנדריטיים. כימות של פרמטרים עצביים מרובים מציע הזדמנות להבין טוב יותר את המנגנון שבבסיס תפקוד קוגניטיבי עצבי.
