הפרוטוקול שלנו מאפשר לנו לעקוב אחר הפצה ביולוגית ולאשר את ההפנמה הספציפית לרקמות של פפטיד של עניין באמצעות שתי מתודולוגיות נפרדות אך משלימות. אנו יכולים להשתמש בפרוטוקול זה כדי למקסם את הנתונים המתקבלים מבעל חיים יחיד ולרכוש נתוני הדמיה פלואורסצנטיים כמותיים. בנוסף, אנו יכולים להשיג תמונות מיקרוסקופ איכותיות.
לאחר רכישת C-terminus שלב מוצק מסונתז C-terminus כובע CTPs עם N-terminus שכותרתו עם Cy5.5 ממתקן סינתזה פפטיד, להפוך אחד או 10 מילימולר פתרון מלאי aliquot של CTP ב דימתיל סולפוקסיד לאחסון במינוס 80 מעלות צלזיוס מוגן מפני אור. ביום הניסוי, לטעון מנה של 10 מיליגרם לקילוגרם של Cy5.5 CTP ב 200 microliters של PBS לתוך מזרק אינסולין. שקלו עכבר והעבירו את הפפטיד דרך הווריד לעכבר ה-CD1 הנשי בן ששת השבועות.
אפשר לפפטיד לזרום לתקופת הזמן הניסיונית שצוינה מראש לפני המתת חסד של העכבר באמצעות תא CO2 בעל זרימה גבוהה ושימוש במספריים כדי לפתוח את חלל החזה ולהפוך חתך קטן בקיר החופשי בצדדים של ה אטריום הנכון. השתמש מזרק חמישה מיליליטר מצויד מחט מד 26 כדי לתבונן שלושה מיליליטר של 10% אוגר פורמלין פוספט דרך איפקס החדר השמאלי כדי לתקן את הרקמות כדי לשטוף את כל תאי הדם האדומים. לאחר מכן לאסוף את הלב, הריאות, הכבד, הכליות, הטחול, המעי הגס והקטנה, שלפוחית השתן, השחלות או האשכים, ואת המוח לתוך בארות בודדות של צלחת 12 באר עבור הדמיה אופטית לשעבר ויוו.
להדמיית in vivo של התמונות שהותנו ב- CTP, הפעל את תוכנת רכישת התמונה ולחץ על אתחול כדי להכין את המערכת להדמיה. פתח את אשף ההדמיה ובחר זוג פלואורסצנטיות וסינון. לחץ על שמות, צבעים, ציאניד ו- Cy5 כדי להגדיר את פרמטרי העירור וההפחתה.
ולחצו על 'הגדרות ידניות' כדי להגדיר את החשיפה לשנייה אחת, את החיבור ל-Small, את ה-F/Stop לשמונה ואת שדה התצוגה ל-15 ס"מ. לחץ על רכוש והגדר את התיקיה שבה יש לשמור את הדוגמאות. הוסיפו את המידע הניסיוני המתאים בחלון 'עריכת תוויות תמונה' ולחצו על הלחצן 'אשר'. התמונה שנרכשה תופיע.
הגדר את היחידות ליעילות קורנת. לחצו פעמיים על התמונה ולחצו על 'תיקונים' ו'חיסור רקע פלואורסצנטי מסתגל'. התאם את הסף כדי לכסות רק את איברי העניין בסגול.
לחלופין, לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני ובחר חתוך אזור כדי לצייר תיבה המכילה את כל הדוגמאות המעניין. כאשר כל התמונות נרכשו, להעביר את הדגימות לתוך בקבוקונים scintillation המכיל 10% אוגר פורמלין פוספט בנפח של לפחות 20 פעמים מזה של הרקמה ולאחסן את הרקמות בטמפרטורת החדר מוגן מפני אור לפחות 48 שעות. כדי לכמת את התמונות, הגדר את היחידות ליעילות קורנת ואת אזור העניין לארבע על שלוש.
התאם את אזור תיבת הריבית כדי לכסות באופן שווה את כל הבארים ולחץ על מדידת אזורים מעניינים. לאחר מכן לחצו על 'אזור רשת של מדידות עניין' כדי להתאים לתאי אזור העניין ולחצו על 'ייצוא' לשמירת הנתונים בקובץ טקסט או CSV. כאשר האיברים קבועים מספיק לאחר מינימום של 48 שעות, להעביר את הדגימות לתוך עיבוד רקמות הטבעה קלטות לטעון את הקלטות לתוך מכונת עיבוד רקמות.
הגדר את המעבד לייבש את הרקמה עם אתנול כפי שצוין, ואחריו ניקוי עם שני טיפולים קסילן 30 דקות עירוי פרפין עם ארבעה 30 דקות טיפולים פרפין. לאחר הטיפול האחרון בפרפין, הסר את הרקמות ממכונת העיבוד. מניחים את הרקמות בתבניות מתכת בודדות ומרווים כל עובש בפרפין מותך.
מניחים את התבניות על צלחת קרה. כאשר הפרפין בתחתית התבנית מתחיל להתגבש, מניחים את האיברים בפרפין. כאשר כל האיברים הונחו, מניחים קלטת מסומנת על גבי התבנית כגיבוי וממילוי יתר של התבניות בפרפין מותך.
אפשר לפרפין להתקרר עד מוצק לפני אחסון בלוקים במינוס 20 מעלות צלזיוס לילה. למחרת בבוקר, להקים microtome עם זווית להב של שש מעלות ועובי קטע של 10 מיקרומטר ולהעלות את בלוקי הרקמה לתוך microtome. התחל לחתוך עד חלקים המכילים את הרקמה מתקבלים למקם את הבלוקים עם הפנים כלפי מטה באמבט מים מזוקק 38 מעלות צלזיוס במשך חמש דקות או עד הרקמה ספגה קצת לחות.
כאשר קו מתאר לבן דק של הרקמה מופיע בבלוק, מניחים את הרקמה על גוש קרח שטוח במשך 10 דקות לפני החזרתה למיקרוטום באותו כיוון שבו הוא היה טעון זה לזה. התחל להשיג פרוסות המאפשרות למקטעים חתוכים ליצור סרטים ארוכים של שישה עד עשרה מקטעים כל אחד. כדי להבטיח רכישת מקטע רקמות מוצלחת, שמור על הבלוק hydrated.
החזר את הבלוק לקרח אם איכות המקטע ירודה או אם מתחיל לרדת. השלך סרטי פרפין תת-אופטימליים עד להפקת רצועת כלים באיכות גבוהה באורך מספיק כדי לכסות שקופית. השתמש בקצה קהה כדי להעביר סרטים איכותיים לתוך אמבט מים 38 מעלות צלזיוס ולתת את החלקים לשבת על פני השטח של המים מזוקקים עד שהם פשוט להחליק החוצה.
לצוף את החלקים שטוחים על פני השטח של מגלשת זכוכית נקייה ולהמיס את השעווה בתנור 65 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות. כדי deparaffinize את השקופיות, לטפל בדגימות שלוש פעמים עם קצילן במשך 10 דקות לטיפול. לאחר הטיפול האחרון קסילן, rehydrate את הרקמות עם חמש דקות יורד טבילות אתנול כפי שצוין, ואחריו טבילה של חמש דקות מלוחים טריס-buffered.
לאחר מתן אפשרות לשקופיות להתייבש בן לילה, הר את החלקים עם כיסויים ו- 125 מיקרוליטרים של מדיום הרכבה בתוספת DAPI וייבש את השקופיות בן לילה המוגנות מפני אור לפני הדמיה על ידי מיקרוסקופיה פלואורסצנטית. לאחר קיבעון, הלב, הריאות, הכבד, הכליות, הטחול והמוח מבעלי חיים ניסיוניים ושליטה מסודרים בצלחת של 12 באר להדמיה פלואורסצננטית אופטית לשעבר של vivo. עם המרת הספירות ליעילות קורנת, ניתן לכמת את נתוני הפלואורסצנטיות עבור כל קבוצה של איברים.
חשוב לציין שאיברים שונים מפגינים פלואורסצנטיות אוטומטית בתגובה לאורכי גל שונים של בעירור. אורכי גל קצרים יותר של העירור כגון חלבון פלואורסצנטי ירוק משופר קשורים לרמות גבוהות יותר של פלואורסצנטיות אוטומטית במיוחד בכבד ובמוח מאשר אורכי גל של בעירור אדום או כמעט אינפרא אדום. קיבעון פורמלין והטבעת פרפין של מקטעי רקמות מכל איבר מאפשר ניתוח immunofluorochemical של סמני תאים מעניינים, כמו גם כימות של תאים חיסוניים או סטרומה של עניין בתוך כל רקמה.
התאם את הגדרות ההדמיה כדי למנוע רוויה ועקוב אחר ההגדרות שלך ולאחר מכן החל את אותן הגדרות רכישה על דוגמאות אחרות באותו ניסוי לקבלת עקביות ודיוק. אימונוהיסטוכימיה יכולה להתבצע גם על מקטעי הרקמות אם פפטיד חודר לתאים מועמד מתעניין במבנה או בחלבון מעניין.
