פרוטוקול זה מספק מתאר מפורט של איך לתאי גזע עיסת שיניים שיתוף עם נוירונים trigeminal. עם זאת, אנחנו יכולים לחקור תגובות מרובות מונע על ידי crosstalk שלהם. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא היכולת ללמוד ולתפעל אוכלוסיות תאים או שתיהן ולמדוד במדויק את התוצאות.
שיטה זו יש רלוונטיות ישירה למחקר עצבי והוא יכול לספק תובנה לתוך מחקר על איך תאי גזע עיסת שיניים לתקן רקמה עצבית פגום על ידי אירועים טראומטיים או מחלות ניווניות. יש כמה שלבים של טכניקה זו ללמוד וזה יכול להיות קשה לשמור על דרכי כולם. פרוטוקול זה מפרט כל שלב כדי לעזור עם זה.
עיסת שיניים וגנגסטרים קשה לפזר ודורשים מערבולות שונות pipetting. גם אז לא תקבל פיזור מלא כך אופטימיזציה ושכפולים יידרשו. לאחר המתת חום של העכבר, מניחים את הראש על האנדרפד החד פעמי, כך שהפה הוא לכיוון התקרה ואת הבסיס של הצוואר שטוח על משטח העבודה.
השתמש בסכין גילוח ותהל מנסר כדי להפריד את הגמלייה מהמקסילה. הסר את הלשון עם מספריים או מדפים כדי לאפשר גישה קלה יותר לטוחנות. מניחים את הראש הפתוח בצלחת על משטח גזה סטרילי ומ מניחים את הדגימה מתחת למיקרוסקופ הניתוח.
הסר את רקמת העצם המהותית המקיפה את הטוחנות הראשונות. הכנס מלקחיים לתוך פתח מכתשיים להקניט את הרקמה מן השן לכיוון buccle או בצד ה לשוני של הפה. לאסוף את כל הטוחנות הראשונות maxillary בעדינות להעביר את התת-מנדבי ואת טוחנות תחילה maxillary לצלחת תרבות תאים נפרדת עם 1X PBS על קרח.
הסר את האיבר החיצוני אמייל המקיף את החלק החיצוני של כל טוחן תחילה maxillary. עם קבוצה של מדפים לסובב את הטוסר כך cusps הם למטה ואת השורש הפתוח חשוף. יש פתח אליפטי בתחתית השן ורמת עיסת שיניים אטומה עגמה על ידי שכבה דקה של דנטין ואמייל.
באמצעות קצה המדפים, בעדינות לשחרר את עיסת השיניים על ידי הפעלת זרוע אחת של המדפים סביב ההיקף הפנימי של הרקמה מינרלית. מוציאים את רקמת העיסה הדנטלית מהמבנה המינרלי ומעבירים לצלחת שלישית המכילה 1X PBS. הסר את האיבר החיצוני אמייל אם זה לא היה כבר מופרד.
מעבירים את כל רקמת עיסת השיניים ל-0.25% טריפסין EDTA בצינור חרוטי של 50 מיליליטר. Vortex את התערובת ומ מניחים אותו באמבט מים חמים 37 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות. מתחת למכסה המנוע הסטרילי, הוסף מדיה מחוממת של תרבות-משותף ליחס סופי של מדיה של אחד לאחד לפחות כדי לנסות להשבית את האנזים.
צינור התקשורת למעלה ולמטה מספר פעמים עם צינור 10 מיליליטר כדי לפזר עוד יותר את עיסת שיניים בתקשורת, למנוע בועות גדולות. מעבירים מיליליטר אחד של עיסת השיניים המפוזרת לכל באר של צלחת תרבות רקמות 24 באר. מניחים את הצלחת באינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס.
ולאפשר לתאים לצרף ולעבר החוצה מן הרקמה undispersed במשך 48 שעות לפני שינוי מדיה. לאחר המתת יתד והסרה של העור, הכנס את קצה זוג מספריים לנתח מיקרו לתוך הבסיס של הגולגולת. חותכים לאורך התפר הסגיטלי של הגולגולת.
בצע ארבעה חתכים אופקיים קטנים לאורך התפרים הכתר על ידי האוזניים עד לאורך התפרים lambdoid של בסיס הגולגולת. זה יוצר שני מדפים של עצם. השתמש במקלפים כדי לקלף בחזרה את שני מדפים של עצם כדי לחשוף את המוח.
אתר את הגנגמליה הטריגמינאלית שוכנת בדורה מאטר בין המוח לעצם של תהליך מקסילרי. חותכים את שלושת הענפים שנוסעים לעיניים, מקסילה, ו mandible. ולהשתמש במטליות עדין קצה ישר להעביר את הגנגליה קר 1X PBS בצלחת על קרח.
לאחר כל החבילות trigeminal נקצרים להשתמש מטליות קובץ להעביר גרעינים ל 50 צינור חרוט מיליליטר המכיל חמישה מיליגרם למיליליטר של קולגנס מסונן סטרילי סוג II.Vortex את התערובת ולמקם את הצינור באמבט מים 37 מעלות צלזיוס במשך 25 עד 30 דקות. כל חמש עד עשר דקות, תוציא את הצינור מהאמבטיה, המערבולת, ותחזור לאמבטיה. צנטריפוגה פתרון נוירון טריגמינלי קולגן במשך שתי דקות ב 643xg.
מתחת למכסה המנוע של תרבות הרקמה, שאפו בעדינות את הקולגן עם מיקרופיפט והוסיפו חמישה מיליליטר של 1% טריפסין מסונן סטרילי II.Then מניחים את הצינור באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס למשך 25 עד 30 דקות ובתוך פרק זמן זה מערבולת הצינור לזמן קצר כל חמש דקות. הוסף מדיה ביחס של אחד לאחד של טריפסין למדיה כדי לבטל את ההפעלה של טריפסין הנותר. לספור את מספר התאים לדלל את התערובת ל 200, 000 תאים למיליליטר במדיה.
מניחים מסנני טרנסוול מצופים לתוך בארות עם עיסת שיניים. Pipet 250 microliters על מסנן transwell ותרבות התאים ב 37 מעלות צלזיוס לילה. למחרת, להחליף את התקשורת עם מיליליטר אחד של מדיה שיתוף תרבות בתוספת uridine micromolar אחד ו 15 micromolar 5-Fluoro-2'deoxyuridine כדי לעצור את התפשטות יתר של תאים mesenchymal שעשוי למנוע נויריט יצוק.
אתה חייב להוסיף מעכבי מיוטי ביום השני או צמיחה neurite לא יתרחשו. במחקר זה, נויריט trigeminal גדל בנוכחות תאי עיסת שיניים ראשוניים הבאר הבסיסית לעומת השליטה של מונוקולטורה neurite trigeminal. תאים ראשוניים מבודדים קולטן TGF-בטא 2 פלוקס / פלוקס העכבר היו שווים במספר לאחר זריקות של ade-Cre-GFP או ade-eGFP.
PCR כמותי למחצה מדגים כי adenovirus-Cre-GFP מחק את הגן אגף הפיכת קולטן בטא גורם גדילה 2 עם אדנווירוס-eGFP משמש וקטור ויראלי שליטה. בתרבויות עם שינוי פקטורי גדילה קולטן בטא 2 מחיקה, צמיחה neurite ירד. הדמיה שדה בהיר של מסנני transwell לאחר הכתמת סגול גביש של אוכלוסיות תאים מראה כי נקבוביות גדולות נפוצים.
החץ הגדול מצביע על תא עם מורפולוגיה mesenchymal ואילו החץ הקטן מצביע על תא של מורפולוגיה עצבית. סגול קריסטל מוכתם בשני התאים ללא הטיה. בנוסף, כתמי שפעת חיסונית של בטא-III tubulin עם נוגדן משני alexa 488 מראה כתמים לא ספציפיים של תאים מרובים מה שהופך הדמיה של מבנים afferent קשה.
מכיוון שלא תאי עיסת שיניים ולא נוירונים טריגמינליים להתפזר בקלות, כל חוקר יצטרך לייעל את הליכי הציפוי שלהם. אם אתה תרבות תאי עיסת שיניים לבד בארות נפרדות אתה יכול להשתמש immunofluorescence או שאתה יכול לכמת RNA או רמות חלבון כדי לקבוע כיצד תאי עיסת שיניים מגיבים הנוירונים. זכור להלבין את כל מיכלים או טיפים שבאים במגע עם אדנווירוס.
הקפד להשליך סכיני גילוח כראוי בפח חד.
